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用酶解苦荞麸皮蛋白生产活性肽方法
发布日期:2018-05-24  来源:网络  浏览次数:1754
苦荞的营养价值不仅在于常量营养成分组成特殊,其蛋白质的必需氨基酸组成合理,淀粉中抗性淀粉比例较高,脂肪中的不饱和脂肪酸比例很高,而且含有多种微量元素、手性肌醇、芦丁、槲皮素等对人体具有保健作用的成分。正是由于这些特殊的营养组成,使得苦荞具有降血糖、降血脂、降血压、抗贫血、抗疲劳、抗氧化等多项保健功能。

  苦荞的营养价值不仅在于常量营养成分组成特殊,其蛋白质的必需氨基酸组成合理,淀粉中抗性淀粉比例较高,脂肪中的不饱和脂肪酸比例很高,而且含有多种微量元素、手性肌醇、芦丁、槲皮素等对人体具有保健作用的成分。正是由于这些特殊的营养组成,使得苦荞具有降血糖、降血脂、降血压、抗贫血、抗疲劳、抗氧化等多项保健功能。

  1.酶解原料的制备

  苦荞麸皮蛋白是以提取黄酮后的苦荞麸皮为原料,通过碱法提取等电沉淀制备得到。该蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,其中氨基酸组成比较丰富且疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脯氨酸和精氨酸等含量较高,而这些氨基酸有利于得到含量较高的活性肽物质。

  用该蛋白作为酶解的原料,不仅容易得到具有一定氨基酸组成的目标产物,而且使资源得到了综合利用,同时又排除了其活性源于黄酮的假设,从而简化了工艺。

  2.苦荞麸皮肽的生产

  (1)预处理在酶水解之前,应该对酶解原料进行必要的高温预处理,目的有3个:①使蛋白质变性。打开肽链结构,使分子结构松散,增加酶的作用位点,同时降低溶液的黏度,使分子运动更加自如,从而加快水解速度。②杀菌。避免杂菌过度生长,而出现不可预期的水解效果或者使其表观水解度增大。③纯化胰蛋白酶抑制因子。使后期的水解过程中胰蛋白酶能够发挥正常作用。

  (2)酶的选择与应用为了得到含量更高、活性更好、成本更低的肽类物质,应该从以下4个方面进行酶的选择:①酶的种类。应该选择内肽酶,而不应选择端肽酶,从而避免水解产物中出现过多的游离氨基酸,提高产率并减少因氨基酸过多所带来的测定干扰及后续分离难度。另外最好根据水解的特异性进行选择。②酶的来源。考虑到食用的安全性及生物活性的正常发挥,应尽量选择来自动物消化道的酶系,如胃蛋白酶、胰蛋白酶。另外,碱性蛋白酶(Alcalase)是微生物酶,来源广泛、成本低,适合工业化生产,是较理想的工业用酶。③酶的最适条件。由于最终的生物活性要经过人体消化系统的检验,所以在酶解时尽量选择与人体胃肠道环境相接近的酶系,这样可避免体内外活性出现高度反差。④多酶复合体系的筛选。在对复合酶进行水解条件优化时,不应盲目地将酶任意组合,也不宜将水解度大的酶两两组合。或许两种水解度高的酶作用位点相同,将两酶复合后自然不会引起水解度的增加。相反,将水解度高的酶与水解度低的酶结合使用,有可能获得更好的水解度或得到活性更强的目标肽。

  (3)指标设定目前,活性肽的生产都是以水解度(水解度是指被水解的肽键的数目和原料蛋白的肽键数目的比值)作为衡量指标,分析大量资料后发现,水解度不宜作为活性肽生产的指标,而应以最终的活性作为指标,原因有4个:①游离氨基酸过分地强调水解度,会造成蛋白质的过度水解,产生过多的游离氨基酸,而多肽得率下降。②酶的种类和来源由于不同酶的作用位点不同,切下来的肽链结构和长度不同,对水解度的贡献自然也不同,但其活性却有可能相同。③预处理杂菌过度生长,会出现不可预期的水解效果,并使表观水解度增大,但未必会得到活性很高的产物。④水解度本身就很难精确得到确定水解度时要用到多项检测值和多种试剂,这必然会增加测定误差;不利于得到准确的水解度值。可以通过以水解时间、水解过程中消耗的氢氧化钠体积数和可溶性氮等指标作出大致的估计。

  水解过程中消耗的氢氧化钠体积数水解度测定方法是基于水解过程中pH值不断变化,为了使体系的pH值保持恒定,就要不断地滴加氢氧化钠,所以通过消耗的氢氧化钠体积数就可大致掌握水解的程度。

  可溶性氮指标则随着水解的进行,肽链越来越短,溶解度则相应增大,通过测定可溶性氮的增加量或者浊度的降低值,即可大致估计水解的程度。

  (4)活性测定将活性作为最终检测指标的情况下,选择或建立一种高效快速、准确灵敏、经济实用、简便易行的检测方法就显得尤为重要。如目前降血压活性的测定方法有分光光度法、荧光光度法、放射化学法、高效液相色谱法、毛细管胶束电动色谱法、高效毛细管电泳法等,可以根据自身条件选择不同的方法。

  (5)活性肽的分离、纯化和表征酶法水解苦荞麸皮蛋白生产的活性肽其理化性质可能完全不同,如分子量分布、氨基酸组成、带电量、pH值、极性,因而对于具有生理活性的目的产物其分离纯化方法可能会有很大的不同。另一方面,往往在一种酶解条件下得到的目标产物的分离纯化方法和条件彳艮难移植于另一条件下的产物。所以活性肽的分离和纯化是一项很复杂很艰巨的工作。

  在进行分离纯化时,最好是将分离原理不同的两种或多种手段结合使用,从而使得到的目标产物更纯。如凝胶层析和电泳结合使用,离子交换和分配层析结合、HPLC和超滤结合等等都已成功地用于活性物质的分离和纯化。

  3.发展方向

  (1)苦味脱除可能导致的功能性降低问题在蛋白质水解生产肽的过程中,必然伴随有苦味的产生。目前已有许多相关的研究报道,但大多集中在对苦味机理的推测及苦味的脱除这两方面,今后宜侧重从源头上切断或减弱苦味的产生以及在生产过程中进行脱苦。从已有的报道看,脱苦都是先分离到活性肽然后对其苦味进行评价。对活性肽的评价应重在功效,如果没有发现对人体不利的影响,则不应该盲目地脱苦。应当在处理前后对活性作进一步测定,再根据活性降低情况决定要不要脱苦。可能的话,还应该对脱下来的苦味作单独的活性测定。

  (2)活性的差异最终产品的活性必须经过人体的临床试用才能得到真正的检验。许多资料表明,活性肽在试验动物和人体、体外和体内表现出不同的活性。在以后的研究中应予注意。

  (3)对酶水解物进行多种活性的测定天然产物往往具有多种生物活性,而目前的研究大多研究一种活性,对同一水解物进行多种生理活性功能的平行测试,可以扩大最终产物的适用人群范围,从而为产品进入市场作好准备,为基础研究、产品开发和市场运营提供更好的衔接。

 

 

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