王碧莲 姚雄军 华达生化科技饲料（湖北）有限公司
一、范围
　　本标准规定了饲料中水溶性肽含量测定方法。
　　本标准适用于饲料原料、配合饲料。检测范围为比色溶液中亮氨酸中氮含量4-20mg/l。
二、引用标准
　　下列标准所包含的条文，通过本标准中引用而构成为本标准的条文，本标准出版时，所示版本均为有效，所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
　　GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法
三、方法原理
　　先将试样中可溶性蛋白质、游离氨基酸和氨在水中提取出来，部分提取液在110℃，6mol/l盐酸中水解24h成单个氨基酸，经茚三酮显色反应在570nm处测定总氨基酸氮含量，以提取液直接与茚三酮显色反应在570nm处测定的游离氨基酸氮含量为空白，水溶性肽含量即是总氨基酸氮含量减去游离氨基酸氮含量后再乘以转换系数。 本方法中样品在酸水解过程产生的游离氨所带来的误差忽略。
四、试剂
　　本标准所用试剂，除特殊说明外，均为分析纯。
　　实验室用水应符合GB/T6682中三级水的规格。
4.1 乙酸钠缓冲液4M PH5.5：称32.8g无水乙酸钠于100ml容量瓶加60ml去离子水，缓慢加热溶解，冷后加10ml冰乙酸，用水定容,贮存备用。
4.2 盐酸（GB622）
4.3 0.1mol/l盐酸：8.3ml盐酸（GB622）注入1000ml水中，贮存备用。
4.4 茚三酮：称1.67g茚三酮(HG3-984-76)于250ml容量瓶，加125ml乙二醇甲基醚（Fisher E182）,加7ml冰乙酸，25ml 4M NaAc缓冲液（4.1），用水定容，该试剂可稳定一年，贮存棕色瓶中。
4.5 硫酸肼：称0.26g硫酸肼（GB698-77）到1升容量瓶，溶于去离子水，加 3-4 滴浓H2SO4, 用去离子水定容，贮存棕瓶可稳定1年。
4.6三氯乙酸：25g三氯乙酸(HG3-1105-77)于100ml容量瓶中，加水定容。
4.7 氨基酸标准贮备液：（1000mg氨基酸氮/L）将L-亮氨酸（L-leucine）含氮10.67%在真空干燥皿中50℃ 干燥过夜。称0.937g干燥L-亮氨酸于100ml容量瓶，并用0.1mol/l盐酸（4.3）溶解，并用0.1mol/l盐酸（4.3）定容，此溶液4℃ 下可稳定一个月。
4.8氨基酸标准工作液：移2、4、6、8、10ml标准贮备液（4.7）于100ml溶量瓶中，用0.1mol/l盐酸（4.3）定容成20、40、60、80和100mg氨基氮/L,此溶液4℃下可稳定一个月。
五、仪器、设备
5.1实验室用样品粉碎机
5.2分析天平
5.3磁力搅拌器
5.4涡流混合仪
5.5离心机
5.6反应瓶：类似安瓿瓶，能密封
5.7电热恒温箱：110℃±1℃5.8注射过滤器：带0.45μm滤纸
5.9真空干燥器
5.10电热恒温水浴：90℃±1℃
5.11分光光度计：备1cm比色杯，570nm
六、试样的制备
　　选取有代表性的饲料样品，至少500克，用四分法缩减至100克，磨碎，并过0.25mm孔径（60目），充分混均后装入磨口瓶中备用。
七、分析步骤
7.1 提取
　　称取约2g样品，精确至0.001g于磁力搅拌器（5.3）中加入20ml水，强力快速搅拌2min，用快速滤纸过滤，收集滤过物（置于4℃冰箱中）。
7.2 提纯
　　取上述提取液（7.1）8ml于离心管中，加2ml 25%三氯乙酸（4.6），并用涡流混合仪（5.4）混匀，室温下放置反应1h后，用离心机（5.5）离心2500r×25min，移取上清液于另一试管中备用（或置于4℃冰箱中）。
7.3 水解
　　取2ml提取待测液（7.2）于5ml反应瓶中（5.6），加2ml浓盐酸（4.2）混匀、抽真空、冲氮气并密封，于电热恒温箱（5.7）110℃水解24h后，取出冷却至室温；用注射过滤器（5.8）过滤，取滤液1ml于另一个5ml小烧杯中并置于真空干燥器（5.9），抽真空，直到样品完全干燥，再加4ml水溶解烧杯中残渣，待测。
7.4 标准曲线测定
　　取各个氨基酸标准工作液（4.8）0.2ml， 0.1mol/l盐酸（4.3）0.2ml于20ml比色管中，各加2ml茚三酮溶液（4.5）和10ml硫酸肼溶液（4.4），混匀，置于90℃水浴（5.10）15min，取出快速冷却至室温，以盐酸空白比色为参照用1cm比色杯于分光光度计（5.11）570nm处测试吸光度，以氨基酸氮含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
7.5 试样的测定
　　准确移取提纯液（7.2）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步骤测定吸光度，从标准曲线（7.4）查得试样提纯液的氨基酸氮含量(a)。
7.6 水解样的测定
　　准确移取水解后水溶解样品液（7.3）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步骤测定吸光度，从标准曲线（7.4）查得试样水解液的氨基酸氮含量(b)。
八、测定结果的计算
样品中水溶性肽含量（mg/g）按下式计算：水溶性肽含量（mg/g）=（b/m ×mb—a/m×ma ）×3.07式中：a ——由标准曲线查得试样液氨基酸氮含量（mg）b ——由标准曲线查得水解液氨基酸氮含量（mg）ma ——试样稀释倍数(2.5×1.25×50)mb ——水解样稀释倍数(2.5×1.25×5×2×4×20)m ——样品的质量3.07——氮和肽的转换系数
九、允许误差
同一分析者对同一试样两次测定所得结果相对偏差≤10%。