不同蛋白饲料在肉仔鸡消化道中释放小分子肽的特性 中国农业科学院饲料研究所/刘国华 郑爱娟 陈桂兰 张 姝 蔡辉益 原刊于《新饲料》杂志2007年第3期 作者简介：刘国华，男，博士，研究生导师，副研究员，主要从事家禽营养研究。 摘 要：将35只21日龄肉仔鸡随机分为7个处理组，每组5只。各处理组分别强饲50g 70%单一饲料（豆粕、鱼粉、菜籽粕、花生仁粕、玉米蛋白粉、血粉、棉籽粕）和30%淀粉的混合物，研究各种饲料在消化道水解释放小分子肽（<600Da）的特性。结果表明，同一蛋白质饲料在肉仔鸡消化道各部位水解释放的小分子肽占水溶性蛋白质的比例有显著差异，其中腺胃释放小分子肽比例显著低于小肠各段，小肠中则以十二指肠最高，回肠后段最低，空肠前、后段和回肠前段之间无显著差异。不同饲料蛋白在肉仔鸡消化道水解释放小分子肽的比例有显著差异，其比例高低依次为棉籽粕>花生仁粕>血粉>玉米蛋白粉>豆粕>鱼粉>菜籽粕。 关键词：肉仔鸡，饲料，消化，小肽 对动物小肽转运载体的研究表明，只有二肽和三肽能作为转运载体的底物（Klang等，2005）。这就表明肽链长于三肽的肽或蛋白质分子不能直接吸收进入肠黏膜细胞，饲料中的大分子肽或蛋白质只有在肽酶的水解作用下分解为游离氨基酸、二肽和三肽才能被肠道吸收。诸多研究已经证明，就经肠道的吸收而言，小肽较氨基酸具有更大优势，前者吸收速度快（Hara等，1984；Rerat和Nunes，1988；Rerat等，1992；乐国伟等，1997；赵昕红，1998），不易饱和（Steinhardt，1984），吸收效率也更高（Silk等，1980；Hara等，1984），因此饲料在胃肠道消化过程中释放小分子肽的多少可能也影响到饲料营养价值的评价。Savoie等（1989）已经报道了饲料品质影响其在消化道的肽类释放种类和数量的研究结果。王丽娟（2003）也在研究不同蛋白质饲料在鸡空肠释放肽结合氨基酸的特性时发现，劣质蛋白质释放的肽结合氨基酸数量较少，优质蛋白质释放的肽结合氨基酸数量较多。但这些研究都是建立在“肽结合氨基酸”或“寡肽”基础上，而对不同蛋白质原料在鸡消化道中释放可吸收小分子肽（二肽和三肽）的特性尚不了解。 本试验拟采用凝胶过滤色谱的方法，研究不同蛋白质饲料在鸡消化道释放可吸收小分子肽的特性，揭示消化道中肽转运载体底物产生的过程和规律，为小肽营养理论的应用提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 试验动物和试验设计 100只1日龄雄性肉仔鸡，饲养于3层立体肉鸡笼中，采用玉米—豆粕日粮（日粮组成见表1）预饲至21日龄。21日龄时，按体重一致的原则从中挑选35只，随机分为7个处理组，每组5只，每只为1个试验单元。试验饲料为70%单一饲料和30%淀粉的混合物。分别选用豆粕、鱼粉、菜籽粕、花生仁粕、玉米蛋白粉、血粉、棉籽粕（粗蛋白和氨基酸含量见表2）配成7种试验饲料，并加入Cr2O3作为指示剂。全部鸡只预先饥饿12h后，每只鸡强饲试验饲料50g。 表1 基础日粮组成和营养成分 注：1.每千克配合饲料中添加: VA 12000IU, VD3 2500IU, VE 20mg, VK3 3mg, VB1 3mg, VB2 8mg, VB6 7mg,V B12 0.03mg, 泛酸 20 mg, 烟酸 50 mg, 生物素 0.1 mg, Folic acid 1.5 mg，VB 复合物1000mg; Cu 9mg, Zn 110mg, Fe 100mg, Mn 100mg, Se 0.16mg, I 0.6mg; 四环素 60mg. 2.营养成分为计算值. 表2 蛋白饲料中粗蛋白和氨基酸的百分含量 注：表中数据为实测值。 1.2 样品收集和处理 强饲3h后，全部鸡只连续排出绿色粪便，此时静脉注射大剂量戊巴比妥钠麻醉，打开腹腔，取出消化道，分隔成腺胃，十二指肠，空肠前段，空肠后段，回肠前段，回肠后段6部分，将各部分内容物分别收集于试管中，-20℃低温保存。 取肠道内容物1~2g，加3~4ml去离子水，涡旋振荡器振荡10min，4000rpm离心10min，取上清液，0.45µm滤膜过滤，-20℃低温保存待测。 1.3 样品分子量分布的测定 采用高效凝胶过滤色谱法进行测定。 1.3.1 仪器 高效液相色谱仪（Agilent 1100型），紫外检测器。 1.3.2 色谱条件 色谱柱：TSK-gel G1000PW 300mm×7.5mm凝胶柱；流动相：乙腈:水:三氟乙酸=10:9:0.1（体积比）；检测波长220nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样体积20μL。 1.3.3 测定 以Gly-Leu（分子量188）、还原型谷胱甘肽（GSH，分子量307）、氧化型谷胱甘肽（GSSG，分子量613）、维生素B12（分子量1300）作为分子量标准建立保留时间与分子量的线性方程，经计算确定600Da（三肽的平均分子量约为540Da）的保留时间为5.42min。将样品在上述色谱色件下分析，选择5.42min内的峰，积分求得峰面积，其占总峰面积的比值即为大分子肽的相对百分比，剩余部分则为小分子肽百分比。 1.4 数据处理和统计分析 数据进行反正弦平方根转换后，采用Statistica 6.0（Statsoft, Inc.）统计软件ANOVA程序进行二因素方差分析，Fisher’s LSD法多重比较。在二因素互作显著的前提下，分别以饲料作为单因素进行方差分析，Fisher’s LSD法多重比较。显著性水平设为0.05。 2 结果 2.1 总效应 表3显示了不同蛋白原料在肉仔鸡消化道不同部位食糜中水溶性小分子肽含量变化规律。结果表明，不同饲料在肉仔鸡消化道食糜中小分子肽的比例有显著差别（P<0.01），按其释放小分子肽的比例从高到低依次为：棉籽粕>花生仁粕>血粉>玉米蛋白粉>豆粕>鱼粉>菜籽粕，多重比较发现，除豆粕、血粉和玉米蛋白粉之间无显著差异外（P>0.05），其他原料间存在显著差异（P<0.05）。消化道各部位水解蛋白饲料释放小分子肽的能力也有显著差异（P<0.01），由高到低依次为：十二指肠>回肠前段>空肠前段>空肠后段>回肠后段>腺胃，其中空肠前段、空肠后段和回肠前段之间无显著差异（P>0.05），其他各肠段间差异显著（P<0.05）。 试验还发现，小肠肠段和饲料种类之间互作关系显著（P<0.01），表明不同原料在消化道各部位释放小分子肽的情况有明显不同，有必要作进一步分析。 2.2 蛋白饲料在不同肠段释放小分子肽的特性比较 总体而言，各种饲料原料在腺胃的水解程度最低，其中小分子肽的比例占到总可溶性肽（蛋白）的20％～30％，而十二指肠水解释放的小分子肽最多，占到总可溶性肽的40％～70％。其他肠段释放小分子肽的情况在不同蛋白饲料之间有明显差别。其中，豆粕、花生粕、棉籽粕空肠后段释放的小分子肽比例较高，而菜粕、鱼粉、玉米蛋白粉、血粉在肠道后段水解产生的小分子肽比例较小肠前段更低。 比较不同消化道部位蛋白饲料释放小分子肽的比例发现，在腺胃阶段，玉米蛋白粉和血粉水解产生小分子肽较多；十二指肠阶段则除菜籽粕和鱼粉产生小分子肽较少外，其余饲料均较高；空肠前段和后段变化趋势比较一致，均以棉粕和花生粕小分子肽比例较高，以菜籽粕最低，而且不同饲料间差异较小；回肠前段不同饲料之间差异则最为明显，其中豆粕、花生粕和棉籽粕的小分子肽比例较高，菜籽粕最低；回肠后段则除了棉籽粕最高外，其他饲料间差别不大。 表3 不同消化道部位食糜中水溶性小分子肽的百分含量 项目 消化道部位 平均值 腺胃 十二指肠 空肠前段 空肠后段 回肠前段 回肠后段 豆粕 25.90±1.50 56.83±5.90 42.77±5.39 41.72±5.49 57.36±9.53 39.34±11.58 44.42a 菜籽粕 27.00±6.16 44.74±12.94 33.44±6.89 31.45±6.42 28.04±2.62 30.25±1.75 32.68b 鱼粉 23.00±2.09 44.55±8.73 40.71±5.63 42.08±5.50 35.66±5.58 38.57±8.58 37.21c 玉米蛋白 33.11±9.18 62.49±15.65 49.89±10.44 45.63±2.37 42.07±1.61 38.15±5.25 45.22a 花生仁粕 30.26±5.12 65.22±11.49 52.53±4.13 52.15±7.65 56.82±8.47 42.94±9.28 49.99d 血粉 43.66±1.23 57.16±6.85 47.96±2.62 45.91±6.26 43.14±9.52 38.81±8.87 46.11a 棉籽粕 28.24±4.69 67.41±9.14 53.52±7.91 59.10±4.25 62.30±4.96 56.54±4.79 54.67e 平均值 30.26A 56.92B 45.98C 45.92C 47.44C 40.72D 方差分析概率值 饲料间 0.000 消化道部位间 0.000 饲料×消化道部位 0.000 3 讨论 3.1 消化道不同部位对饲料蛋白的水解比较 一般认为，鸡在消化粉碎的蛋白饲料过程中，除肌胃几乎不发挥任何作用外，其他消化道部位都参与蛋白质的水解。由于腺胃中不存在肽转运载体PepT1（Chen等，1999），因此食糜中小分子肽比例高低上反映了饲料蛋白的水解程度。饲料进入消化道后刺激胃黏膜感受器，经迷走神经传导，刺激腺胃分泌含有盐酸、胃蛋白酶原的消化液，部分酶原在酸性作用下激活成为胃蛋白酶，发挥蛋白水解作用。已知胃蛋白酶主要水解亮氨酸和缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸形成的肽键，以及芳香族氨基酸之间形成的肽键，因此含有这些肽键的饲料蛋白更容易被水解。血粉和玉米蛋白粉是本试验研究的7种饲料水溶性蛋白质中亮氨酸含量较高的品种，在本试验中其水解程度也较大，释放的小分子肽也最多，由此推测，饲料蛋白在腺胃的水解可能取决于其氨基酸组成。 在鸡的整个消化道中，十二指肠的消化活动最为活跃，本试验中十二指肠中很高的小分子肽比例也证明了这一点。十二指肠的蛋白酶以来源于胰腺的胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶等内肽酶为主，其中胰蛋白酶的作用最为突出。这些酶共同将蛋白质分解成2~6个氨基酸残基的小肽，同时外肽酶也发挥其作用，将小肽水解为游离氨基酸。而十二指肠黏膜也表达有肽转运载体PepT1（Chen等，1999），因此本试验测得的实际上是小分子肽的消化和吸收两个过程相互作用的结果。 与十二指肠相比，各种饲料蛋白的空肠食糜小分子肽比例都下降。据报道，十二指肠的糜蛋白酶活性高于空肠，而胰蛋白酶活性低于空肠（张铁鹰，2002）。前者对芳香族氨基酸残基敏感，后者对赖氨酸、精氨酸残基敏感，但从所研究的几种饲料蛋白氨基酸含量来看，无法仅仅用两种酶活的变化做出解释。各种蛋白饲料回肠食糜中小分子肽的比例较空肠也有显著降低，这一结果与张铁鹰（2002）关于回肠食糜中蛋白消化酶活性较空肠均呈降低趋势的研究报道一致。 3.2 不同蛋白饲料释放小分子肽的特性比较及其营养学意义 动物消化道中胰蛋白酶、糜蛋白酶以及肠肽酶的分泌受摄入蛋白质的种类、数量、氨基酸组成或他们消化产物的影响（Sonoyama，1994）。Sklan和Hurwitz（1980）也曾经报道，酪蛋白和豆粕在鸡十二指肠中释放小分子肽比例有明显差异。本试验对七种蛋白饲料的比较研究也证明了这一点。 分析整个消化道的蛋白质水解情况也可以看到，各种饲料蛋白具有各自的特征。豆粕在十二指肠和回肠前段产生的小分子肽比例较高，约占到60%的比例，在腺胃阶段则仅占不到30%；菜籽粕除了在十二指肠产生小分子肽比例较高外，在其他部位均较低，仅占总可溶性蛋白质的30%左右；鱼粉则在各个部位生成的小分子肽比例差异不大，均在50%以下；玉米蛋白粉则呈由十二指肠到回肠逐渐降低的趋势；花生粕在肠道各部位均达到50%以上，其中以十二指肠和回肠前段较高；血粉在腺胃就释放出较多小分子肽（40%以上），十二指肠最高，随后呈下降趋势；棉粕除十二指肠外，其他肠段部位差异不显著。 总体来看，棉籽粕在小肠各个消化阶段都产生小分子肽的比例最高，花生粕次之，菜籽粕最低。而通常定义为“优质蛋白质饲料”的鱼粉释放的小肽比例较低，仅略高于菜籽粕，而豆粕除了回肠前段小分子肽释放比例较高外，在其他消化道部位释放的小分子肽均较少。这一结果似乎与以往关于优质蛋白释放寡肽更多的研究结论有很大出入。但事实上本试验结果是在扣除饲料蛋白质消化率的差别上得到的，反映的是不同蛋白质饲料中可消化蛋白的分子量分布的差异。从试验结果来看，鱼粉、菜籽粕、豆粕在小肠水解生成的肽结合蛋白（寡肽）更多以大分子肽（三肽以上）的形式存在，较少以稳定的二肽和三肽形式存在，棉籽粕则与之相反。这一方面可能是因为鱼粉、豆粕等饲料在消化过程中形成的小分子肽与肽转运载体亲合力更强，更易于被小肠吸收或吸收速度更快，因而平衡状态下小分子肽比例较低。另一方面，也可能是因为这些饲料蛋白水解形成的小分子易于被进一步水解形成游离氨基酸，因而降低了小分子肽的比例。根据其他有关鱼粉和豆粕在肠道较少水解形成氨基酸的报道推测，可能是鱼粉和豆粕氨基酸更多地被以小分子肽形式被吸收，而菜籽粕则更多地被水解为氨基酸，反之，棉籽粕生成的小分子肽可能不易被直接吸收转运，且水解为氨基酸的速度也较慢。但目前尚无直接证据支持上述推论。 最近的研究已经证明，动物肠道只能吸收氨基酸、二肽和三肽，分布于小肠黏膜的肽转运载体PepT1对于超过3个氨基酸残基的大分子肽几乎没有亲合力（Klang等，2005），而肽的转运在氨基酸吸收方面的优势和重要性也已确立，本试验也证实了小分子肽在鸡的氨基酸营养中的重要地位。据王丽娟（2003）的报道，鸡小肠食糜中寡肽（肽结合氨基酸）占总氨基酸的65%~80%，本试验测得小分子肽在总可溶性蛋白中所占的比例约在40％~70%，由此推算，小分子肽结合蛋白则占总氨基酸的26%~56%。因此以小肠可吸收肽的形式（二肽和三肽）为动物供应氨基酸可能对于提高饲料蛋白质利用率具有潜在营养意义。 此外，本研究发现棉籽粕、花生粕等饲料蛋白在小分子肽释放的特性也有利于重新评价传统营养学所定义的“劣质”蛋白质原料，并有可能为这些原料的应用开辟新的途径。 测定指标 豆粕 菜籽粕 鱼粉 玉米蛋白 花生仁粕 血粉 棉仔粕 CP 46.68 36.63 63.95 58.86 47.35 42.13 48.47 Asp 4.81 1.91 3.79 0.45 4.97 2.37 3.99 Thr 1.50 0.54 2.10 0.25 1.01 1.41 1.28 Ser 2.15 0.91 4.55 0.41 2.07 1.53 1.93 Glu 7.61 3.20 5.83 1.94 8.25 6.69 8.7 Gly 1.68 5.54 3.54 0.31 2.21 1.82 1.65 Ala 1.82 2.43 2.65 0.48 1.67 1.67 1.68 Cys 0.32 0.04 0.72 0.03 0.30 0.29 0.38 Val 1.84 0.83 2.96 3.37 1.56 1.76 1.77 Met 0.44 0.26 0.65 0.11 0.36 0.61 0.58 Ile 1.78 0.51 2.21 0.26 1.37 1.39 1.27 Leu 3.20 1.13 3.89 0.65 2.75 2.59 2.50 Tyr 1.44 0.30 1.43 0.00 1.55 0.93 1.21 Phe 2.11 0.66 2.29 0.32 2.09 1.43 2.32 His 1.35 0.78 0.91 0.65 1.11 1.64 1.48 Lys 2.69 0.97 1.79 0.23 1.57 0.86 1.87 Arg 3.51 2.05 3.11 0.33 5.08 1.65 5.04 原料 配比 % 营养成分 营养水平 玉米 56.57 代谢能，Mcal/kg 2.85 豆粕 38.32 粗蛋白，％ 21.0 蛋氨酸 0.07 蛋氨酸，％ 0.42 植物油 1.54 赖氨酸，％ 1.07 碳酸氢钙 1.83 钙，％ 0.90 石粉 0.95 有效磷，％ 0.48 盐 0.30 复合预混料 0.42