。新力法和新技术平台的建立为农作物基因功能验证和育种产业化提供原动力。通过植物功能基因组学研究的各种技术和方法，获得相关育种目标性状的控制基因和对其功能的认知是基因工程育种的基础。传统的正向遗传学(Forward genetics)研究已经在模式植物和各种农作物中有不少成功的例子。例如水稻细胞分裂素氧化酶基因、控制水稻分蘖基因和控制水稻粒重的数量性状基因GW2等的克隆都充分显示出这些基因在高产分子育种中应用前景。同时反向遗传学(Reverse genetics)的发展也为研究植物基因功能提供了更便捷的技术，如RNAi技术(RNA interference)和过表达研究。这些技术不依赖于突变体的分离和分析，而是直接验证某些重要基因的功能；同时也有可能直接获得相关转基因株系而用于育种程序。

    现广泛使用的遗传学技术都是通过对基因转录表达量的改变或对基因与蛋白结构的破坏达到对相关基因功能的认知。蛋白质是绝大多数基因的最终产物和功能单位，能否直接通过特异地在蛋白质水平上的干扰来验证基因功能呢?一方面可以人为通过导入蛋白降解(Proteolysis)系统，藉蛋白互作介导特定目标蛋白质的降解，从而从根本上敲除该蛋白，揭示其功能。比如通过引入βTrCP系统引起特异地选择不同磷酸化状态的视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma)的降解；另一方面根据某些生化小分子配体(Ligand)特异结合某蛋白质的特性，用生化小分子处理植物或将其导入到植物体内就会产生特异的突变表型，而模拟该基因的突变体。这就是近年来兴起的一门新的学科领域化学遗传学。化学遗传学途径通过配体特异地结合其目标分子引起突变表型变化而有效地揭示基因功能。人工智能配体或适配体（Aptamer)技术就是化学遗传学的新兴技术之一。

1  人工智能配体技术及其重要应用

    人工智能配体指的是人为随机设计但能特异结合到目标分子上的核苷酸或蛋白肽小片段。利用该配体作为一种“诱变剂”(Mutagen)可以特异地结合靶蛋白，从而达到敲除靶基因生物学功能的目的。这种技术的主要特点是在蛋白水平上直接起作用，特异性极强，可跟抗体媲美；它不破坏基因结构，不降解mRNA，也不破坏蛋白质结构；而且该技术所产生的材料可以当成突变体而用于遗传分析，有利于功能分析整个遗传互作网络的各成员。

    人工智能配体(包括核酸和多肽配体)技术，自1990年问世以来仅在国外的一些先进实验室将其优先用于临床基础研究、以医疗为目的的药物设计和基因治疗，并且显示出强大的应用前景。由16～30个氨基酸组成的多肽配体(Peptide aptamer)技术原本是用来特异地失活靶蛋白，揭示蛋白功能的，除了上述药物设计外，该技术还被用于验证或揭示各种调控网络的成员。人的细胞周期蛋白依赖激酶CDK2的多肽配体首先被获得，并日可以在体外抑制该酶的活性。随后该技术被成功地应用于果蝇（Drosophila)、细菌和酵母的细胞周期蛋白的功能验证和细胞周期蛋白依赖的信号转导途径成员的功能鉴定中。不同多肽配体分别特异地与鸭乙肝病毒(Duck hepatitis B virus，HBV)核心蛋白和人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus-16，HPVl6)早期蛋白互作而形成蛋白聚集体(Aggresomes)，从而有效地阻止了病毒的组装和繁殖。这些实例表明多肽配体技术是一项有效的基因干扰技术。

    这一技术可以通过正向和反向两种策略得以实现。正向策略在酵母和细菌中已经有成功应用的例子。一个长度为16个氨基酸的小肽库被表达到酵母中，分离鉴定了抑制有丝分裂关卡(Mitotic checkpoint)，也称纺锤体关卡(Spindie checkpoint)功能的小肽配体。该配体特异结合到YDR517W蛋白，从而揭示了该酵母蛋白在纺锤体关卡功能的重要作用。细胞周期阻滞(Cell cycle-arrest)的小肽配体以同样的方式获得，并证明该小肽配体特异的阻遏细胞分裂控制途径中的一个激酶CBK。将随机多肽配体库表达到细菌中，发现了一个胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase)缺陷型突变体ThyA—，随后证明该配体可以与该酶ThyA互作而影响它的活性口。在多细胞的复杂生物中，反向遗传学的策略也被成功应用。在果蝇中，细胞周期蛋白依赖激酶DmCdkl和DmCdk2的特异多肽配体被表达到Drosophila中引起眼发育缺陷表型，从而奠定了这些基因在果蝇眼正常发育中的重要功能。

    然而，人工智能配体技术在植物基因功能的研究中尚未见报道。目前仅多肽配体技术在抗植物病毒的研究中有一些报道。因此在植物功能基因组学研究中它还是一个全新待开发的技术，尤其是基于人工智能配体介导的反向遗传学的策略，有很大的开发利用空间。因为只要能够找到某蛋白的特异配体，包括核酸或蛋白质片段，它们就可以在植物体内直接且特异地结合到靶核酸或靶蛋白上，从而干扰或敲除靶基因的生物学功能。下面重点探讨多肽配体技术在植物功能基因组学和抗病毒植物育种等中的应用构思、实例设计和应用前景。

2  多肽配体在植物功能基因组学研究中的工作构思

    绝大多数基因的最终产物是蛋白质并在该水平上实现相应的生化反应和生物功能，因此从蛋白质水平上干扰某基因的功能应该是行之有效的。任何蛋白需要与自身或者其它蛋白质形成二聚体或多聚体才能行使正常功能(图lA)（略），比如像含MADS结构域的转录因子，还有mago nashi等其他蛋白因子。因此从理论上来说，只要找到一个只与目标蛋白结合的小肽配体，然后在植物体内大量表达该配体，它就会特异地结合该目标蛋白而优先形成异常蛋白聚集体，导致目标蛋白在植物体内行驶正常功能的蛋白复合体不再形成，从而破坏其功能。这就是多肽配体工作构思的核心（图1，略）。根据蛋白互作的原理，在理论上来说，都有可能找到一个与目标蛋向特异结合的小肽配体。目标蛋白的小肽配体可以通过酵母的双杂交原理进行。

    该构思的实现可以通过正反遗传学两种策略来实现。在多肤配体反向遗传学策略中，首先以目标蛋白为诱饵(Bait)筛选人工随机合成长度在16～30个氨基酸小肽酵母表达文库，获得与目标蛋白相结合的小肽配体(图1B)（略），再将该小肽配体大量表达到植物体内去特异干扰靶蛋白，通过分析所获转基因植株的表型变化，从而最终确定目标基因的生物学功能(图1C)（略）。在多肽配体的正向遗传学策略中，可以将一个人工随机合成的小肽的表达文库直接导入到植物中去，然后在子代群体中筛选感兴趣的突变体。在获得单位点插入且具有可遗传突变表型的转基因株系后，分离分析所插入的小肽，并排除其插入位点效应，那么突变体的表型就是由于小肽的表达干扰了某一蛋白质而引起的。然后利用该小肽为诱饵，筛选该植物的全基因组表达文库，从而获得被该小肽特异敲除的靶基因。在这两种策略中，目标蛋白和对应的多肽配体的相结合关系及其特异性可通过酵母的双杂交原理来确定。

    任何蛋白或与之相关的蛋白复合体以及控制途径的功能都可通过多肽配体技术加以研究。利用多肽配体特异结合靶蛋白，在蛋白水平上对所感兴趣的植物基因进行特异干扰，有助于精确地理解靶基因在复杂性状起源和形态建成中的生物学功能；而且在解决抗植物病毒病转基因品种培育中潜在的生态风险上具有独特的优越性和应用前景。这里以我们研究组目前所关注的研究内容为例，介绍一下反向遗传多肽配体技术在植物功能基因组学和作物育种中的应用前景。

3  多肽配体技术在植物功能基因组学研究中的应用前景

    杂交育种仍然是水稻、大豆等重要作物育种工作的重点，例如杂交超级稻为中国乃至世界的粮食增产做出了巨大贡献。然而育性控制分子机理和杂种优势形成机理之谜仍然没有破解。随着DNA分子标记、分子遗传连锁图谱构建和图位克隆技术的发展，相关不育基因和育性恢复基因的定位取得较快进展，但还不能直接加以利用。其实植物中控制育性的基因有多种，包括植物自交(不）亲和基因等、减数分裂的控制基因、生殖器官的身份决定基因、生殖器官的功能决定基因和最基本的生物过程功能基因等如RNA拼接复合体(Exon junction complex，EJC)中的msgo nashi基因等。EJC核心为Mago-Y14异源二聚体的RNA结合蛋白复合体。Mago-Y14穿梭于核质的转录和翻译等不同机器之间，参与转录、转录后加工运输和翻译等基本过程，比如它介导NMD(Nonsense-mediated mRNA decay)和拼接等，从而监控各种分子过程的活动的精确性，参与基本生命活动。在动物中它们参与生殖细胞的极性发育等，但在植物中的生物学功能尚不清楚，不过现有数据表明它可能具有控制育性发育的生物学功能。在拟南芥中，mago nashi突变体的花粉或胚胎发育不能正常完成。在酸浆中，我们发现mago nashi可以与含MADS结构域的转录因子MPF2特异互作，而敲除MPF2可引起雄性不育。在苹属(Marsilea vestita)植物中，mago nashi为配子体形成所必需。最近通过RNAi发现拟南芥中mago nashi参与分生组织结构、花粉形成和种子发育。mago nashi是生物中高度保守的具有多种生物学功能的一个重要基因。在动植物间该基因功能上的相似性表明在进化过程中该基因及其相关EJC复合体可能受到相似的选择压力。目前有关水稻mago nashi的多肽配体研发正在进行之中(公丕昌等，未发表)。就是要利用人工配体技术来特异地敲除mago nashi等EJC成员，一方面可以定向地验证EJC复合体在育性决定中的功能，有助于揭示水稻育性决定分子机理，为理解育性决定和杂种优势机理提供新型的遗传材料；同时，所获得的不育系也可能直接为水稻杂交育种所用。另外，基于mago nashi及EJC复合体的保守性，从水稻中研发的小肽配体也许可视为它们的“抗体”而用来抑制其它植物中相应基因，从而为该类基因的在不同植物中功能比较研究提供一个可靠的分子工具，揭示该复合体功能进化规律。

    各种转录调控因子及调控网络、细胞周期途径中的各个重要成员基因和各种重要酶类基因等都是多肽配体技术优先研究的对象。

4  多肽配体技术有望培育低生态危害性、具有广谱抗性的转基因作物新种质

    多肽配体技术在抗病毒植物育种中的利用无疑是一个全新的思路，该技术可能为培育广谱高抗植物病毒和低生态风险转基因作物种质开辟新的途径。利用同类植物病毒某一蛋白的高度保守区段为探针，进行特异多肽配体的研究，所获得的小肽不是来源于病毒，但是又可特异地阻止一系列类似植物病毒在植物体内的繁殖和组装，从而获得全新的安全的广谱高抗病毒的转基因株系。多肽配体技术首先被成功应用到特异结合番茄斑萎病毒(Tospovirus)N蛋白(Nucleoprotein)的多肽配体的筛选及其转基因烟草研究中。随后被用来寻找特异结合番茄金黄色花叶病毒(TGMV)Rep的N末端的多肽配体以提高对双联体病毒（Geminivirus)的抗性。目前已经获得可以结合到多种双联体病毒Reps蛋白的小肽，有望获得广谱双联体病毒抗性的转基因植株。这些研究初步探讨并显示了该技术在植物抗病毒性能提高中的潜能和优越性。

    作物病毒病严重威胁着重要农作物如水稻和大豆等产量。比如水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)、水稻东格鲁球状病毒(Rice tungro spherical virus，RTSV)、水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform  virus，RTBV)、水稻黄斑驳病毒(Rice yellow mottle virus，RYMV)和水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus，RDV)是引起水稻减产的重要病毒病。在我国南方以水稻矮缩病危害最重，北方稻区则以水稻条纹叶枯病发生普遍。包括这两种病毒在内的一系列水稻病毒基因组序列已知。通过大量表达病毒的外壳蛋白基因、正反向的病毒复制酶基因和核酶基因等为目的基因的水稻转基因研究已经取得重要进展，但是这种直接操作病毒自身基因可能导致的一些潜在问题引起人们的关注。转入病毒来源基因可能引起更严重的复合病害或抗病毒转基因植株可能会选择出强毒株系或转基因会与其他入侵病毒可能发生重组而产生新病毒和病毒病。而且近年来各作物优质感病品种比重增大，病毒生理小种增多，耕作栽培制度变化等向着有利于病害发生的方向发展。比如大豆花叶病毒SMV(Soybean mosaic virus)存在多种生理小种且演变速度极快，目前至少已经遗传定位5种生理小种，但对于它们的利用还有一定距离。通过候选基因的克隆策略或差异显示技术也获得了大豆的一些抗病基因同源基因全长cDNA序列和一些大豆花叶病毒接种应答基因。但是根据基因对基因的学说，很难通过遗传操作这些基因有效地提高大豆对花叶病毒的广谱抗性。多肽配体技术的发明为解决这些问题提供了可能。分析大豆和水稻病毒等的外壳蛋白等蛋白组装所必需元件序列的相似性，利用其为探针筛选与其特异结合的人工多肽配体，并大量表达之到水稻或大豆中去特异阻止各种病毒在各作物体内的组装和繁殖，从而获得有效且广谱安全的抗病毒作物转基因株系将是作物抗病毒育种的一个新的重要方向。

5  多肽配体技术的核心技术体系和风险对策

    多肽配体技术的核心就是多肽配体酵母表达库的构建和目标蛋白特异小肽配体的筛选，其核心技术就是蛋白在酵母的双杂交。它面临的主要风险就是能否获得特异结合靶蛋白的小肽配体。因此人工多肽配体技术的关键是要确定所获得的小肽配体与靶蛋白结合的特异性。因为如果小肽配体与靶蛋白结合的特异性不能确定或不强，那么转化小肽配体到植物中，就有可能结合到其他蛋白，而引起复杂的表型变化，其后果是不能正确理解靶基因的功能。为了达到特异地敲除靶蛋白及其复合体功能的目的，我们的策略是以初次用靶蛋白从人工多肽配体库中所获得的小肽配体为探针，通过反复筛选植物的(如水稻或大豆)表达文库，而最终确定小肽配体与靶蛋白结合的特异性。如果原来的靶蛋白为植物源基因，那么在反复筛选植物表达文库时，只有筛到该靶蛋白的小肽配体才可能是特异的小肽配体；如果原靶蛋白是病毒源的基因，在反复筛选植物表达文库时，不能筛到任何阳性结果的则证明小肽配体与病毒蛋白结合的特异性。只有获得植物源蛋白和病毒源蛋白的特异配体，才有可能精确地揭示植物基因功能或获得高抗病毒的植物转基因株系。这就要求有两个高质量的文库(随机多肽配体库和植物表达文库)，其滴度(至少106级)和不同转化子的丰度要足够大。另外，独立实验的佐证也是很重要的。结合RNAi干扰相关基因，如果转基因的表型与多肽配体过表达植株表型变化一致，则进一步表明了多肽配体结合靶蛋白的特异性。

    植物遗传转化的难易仍然是在体内进行基因功能验证的主要瓶颈。建议该技术可在易于转化的植物中先行开展，比如拟南芥和水稻等中。当然，来自不易转化作物的目标蛋白对应多肽配体的功能验证也可先在体外或者利用模式异源体系进行研究，一旦其转化瓶颈被攻克，体内的验证就水到渠成。另外，特异小肽配体植物表达载体构建的合适与否则直接决定了小肽配体能否在植物体内正常表达并与其靶蛋白特异结合。这是该技术的另一个关键环节。小肽配体必须要置于一定的蛋白框架(Scaffold)之中才可能正常工作。在动植物研究中，绿色荧光蛋白GFP无疑可为多肽配体提供一个较为理想的工作平台。

6  结语

    多肽配体技术的研发对验证植物包括水稻等农作物基因功能和作物优质高产育种具有重要的理论意义和应用价值。多肽配体技术的本质就是在蛋白水平上特异抑制靶蛋白，从而使其在体内失去其生物学功能。它是一个全新、强有力的并可以通过正向和反向两种遗传学策路进行基因功能研究的工具。所产生的多肽转基因株系可以当作靶基因的突变体用于遗传学研究，或直接或间接地为育种服务。同时在抗病毒方面，由于最终在植物体内大量表达的是非病毒来源的但可与不同生理小种病毒蛋白保守区特异结合的外源多肽配体，因而它不但可以起到广谱的抗病毒效果而且很大程度上降低了抗病毒转基因植物潜在的生态危害。因此，该技术在植物基因功能研究和转基因作物新品种培育中具有广阔的应用前景。

    作者单位：（中国科学院植物研究所，系统与进化植物学国家重点实验室，北京  100093）

    文章采集：caisy

    注明：国家转基因生物新品种科技重大专项（编号：2009ZX08009-011B）资助