李清丽 王卫国
本研究以谷朊粉为原料，采用胰蛋白酶、复合蛋白酶水解谷朊粉蛋白，以水解度[1]、氮溶解指数[2]为评价指标，以反应pH值、加酶量、底物浓度、反应时间、温度为影响水解度大小的主要因素，筛选这两种蛋白酶的单酶和双酶复合的最佳水解条件。
1 材料与方法
1.1 主要原料与试剂
谷朊粉（河南莲花味精集团）、胰蛋白酶、复合蛋白酶（北京诺维信生物有限公司）、L-酪氨酸（第二军医大学正祥化学试剂研究室，生化试剂）、酪蛋白（北京奥博星生物技术有限公司，生化试剂）、福林酚试剂（实验室自制）、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（Sigma进口分装）、丙烯酰胺（Sigma 进口分装）。
1.2 主要仪器设备
VIS-723G型可见分光光度计、TDL-5-A型大容量离心机、AR2140型电子分析天平、DYY-Ⅲ-6B型稳压稳流电泳仪、DYY-Ⅲ-28c型电泳槽等。
1.3 试验方法
1.3.1 水分含量测定
按GB/T6432—94进行。
1.3.2 粗蛋白含量测定
半微量凯氏定氮法(按GB/T6435—86进行)。
1.3.3 蛋白酶活力测定
采用福林－酚试剂法。
1.3.4 水解度测定方法——甲醛滴定法
1.3.4.1 甲醛滴定法测水解液中氨基氮
取水解蛋白液5.00 ml置于小烧杯中，加入20 ml去二氧化碳蒸馏水并磁力搅拌，用精密pH计指示pH值并加入0.1 mol/l NaOH滴至pH=8.2，然后加入已中和好的甲醛溶液10 ml，记录将其pH值滴定至9.2时所耗0.1 mol/l NaOH的毫升数[3]；作空白试验。水解蛋白液中蛋白质的氨基氮为：

式中：A——滴定样品消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；
B——滴定空白消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；
N——氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/l）；
k——1 mol/l氢氧化钠1 ml相当于氮的质量（g），k=0.014；
V——样品的体积（ml），在该试验中V= 5 ml；
V1——水解液的总体积（ml），在该试验中V1=100 ml。
1.3.4.2 水解度计算公式
水解度＝
1.3.5 蛋白酶水解谷朊粉试验步骤
单酶水解：取一定量的谷朊粉溶于100 ml的缓冲溶液中，在适宜的温度下加热10 min，冷却至酶的最适温度下保温10 min，加酶，在恒温震荡器上震荡一定时间，然后在沸水中放置10 min灭酶活。灭酶活后移取50 ml水解液于离心管离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液进行指标的测定。
复合酶水解：取一定量的谷朊粉溶于100 ml的缓冲溶液中，在适宜的温度下加热10 min，冷却至酶的最适温度下保温10 min，加一种酶在恒温震荡器上震荡一定时间，取出冷却至室温，用酸碱调至第二种酶的pH值，在第二种酶的最适温度下保温10 min，加酶在恒温震荡器上震荡一定时间，然后在沸水中放置10 min灭酶活。灭酶活后移取50 ml水解液于离心管离心（3 000 r/min，10 min），取上清液进行指标的测定。
1.3.6 谷朊粉水解物分子量分布
采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳技术测定水解产物分子量。
2 结果与讨论
2.1 原始谷朊粉基本指标的测定
测得谷朊粉样品的粗蛋白为70.01%，水分为7.51%，总氨基酸为66.78%。
2.2 酶活的测定
测得试验所用的蛋白酶酶活分别为：胰蛋白酶9.659×103 U/g、复合蛋白酶8.64×104 U/g。
2.3 胰蛋白酶水解工艺条件确定
在单因素试验的基础上进行正交试验，试验条件T＝40 ℃、pH＝8.5，正交试验的因素水平见表1。

本试验选择L9（34）正交试验表，试验结果及数据的极差分析如表2。

通过极差分析方法可知，在T＝40 ℃、pH＝8.5的条件下，三因素对水解度影响的大小顺序是：酶浓度>水解时间>底物浓度，其中酶浓度、水解时间影响显著(P<0.05)。以水解度要求大的角度考虑，最佳试验方案应选A3B1C3，此条件下的水解度为12.38％。
2.4 复合蛋白酶酶解工艺条件研究
试验条件T＝50 ℃、pH＝6.3，正交试验的因素水平见表3。
本试验选择L9（34）正交试验表，试验结果及数据的极差分析见表4。

通过极差分析方法可知，在T＝50 ℃、pH＝6.3的条件下，三因素对水解度影响的大小顺序是：酶浓度>底物浓度>水解时间，其中酶浓度、底物浓度影响显著(P<0.05)。以水解度要求大的角度考虑，最佳试验方案应选A2B2C3，此条件下水解度为12.13％。
2.5 复合酶水解
复合酶试验采取先加胰蛋白酶酶解，再加复合蛋白酶酶解。得到的优化水解条件为胰蛋白酶9%，底物浓度为1.0％，pH值为8.5，温度40 ℃，时间5 h；复合蛋白酶浓度1.5%，底物浓度为1.5％，pH值为6.3，温度为50 ℃，时间7 h，测得水解度为23.26％。
2.6 酶解谷朊粉水解物分子量分布
测定结果表明，胰蛋白酶与复合蛋白酶复合水解谷朊粉，大部分的水解产物的分子量均在1 000以下，达到了水解的目的。
参考文献
1 吴健中.双酶法生产低苦味大豆多肽的研究.Science and Technology of Food Industry,2003（4）:23~26
2 Berot S, Popineau Y,Compoint J. P,et al. Ultrafiltration to fractionate wheat polypeptides. Journal of Chromatography B.,2001(753):29~35
3 赵新淮.蛋白质水解物水解度的测定[J].食品科学，1994(11)：65~67
（编辑：刘敏跃，lm-y@tom.com）

李清丽，河南工业大学生物工程学院，450001，河南郑州。
王卫国（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2007-04-26
★ 河南省科技攻关项目的部分研究内容，项目号：0424030026