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達邦蛋白-P(水解黃豆蛋白)於白蝦飼料中取代魚粉之飼養評估
发布日期:2010-03-20  来源:互联网  浏览次数:6380
 執行單位: 國立屏東科技大學水產養殖系鄭文騰教授委託單位:達邦蛋白股份有限公司;台榮產業股份有限公司執行時間: 2

 
執行單位: 國立屏東科技大學水產養殖系鄭文騰教授
委託單位:達邦蛋白股份有限公司;台榮產業股份有限公司
執行時間: 2009年6月1日至8月8日
2 摘要
以達邦蛋白-P取代白蝦飼料中之魚粉0%、5%、7.5%、10%、15%及20%後餵飼白蝦8週,結果顯示,各處理組間之活存率沒有差異,取代量10~15%可以稍微增加飼料換肉率,促進成長,取代量達20%之成長與控制組沒有差異;取代量在5~10%間可以稍微增加免疫清除作用與抗病能力,而取代量20%其免疫抗病力與控制組沒有差異;添加量達10%以上之組別,經4週以上之餵飼可以增加水中之硝化作用,降低水中亞硝酸-氮之含量。以不影響養殖效果並降低飼料成本考量下,本研究建議達邦蛋白-P可取代白蝦飼料中魚粉量達20%,即白蝦飼料中可添加達邦蛋白約10%。

一、前言
白蝦 (Litopenaeus vannamei) 原產自中南美洲,於1997年重新定名為L.vannamei (Pérez-Farfante and Kensley, 1997)。台灣於1985年引進後已成功地建立繁殖技術,但當時適逢草蝦 (Penaeus monodon) 養殖鼎盛時期,未受業者的青睞,之後因草蝦 (P. monodon) 及斑節(Marsupenaeus japonicus) 相繼遭受病毒的侵襲,養蝦產業因此一厥不振, 1998年業者自夏威夷再度引進無特定病毒種蝦 (specific pathogen free, SPF),並在高雄、屏東兩縣進行商業化養殖,且由於白蝦對低鹽度具有良好的滲透壓調節能力,加上白蝦對環境具有較高耐受力及生長快速等優點,發展內陸養殖方式頗具成效,因此白蝦養殖逐漸興盛。根據漁業年報之統計,2007年白蝦養殖面積已達2,447.2公頃,年產量10,165噸,白蝦養殖繼草蝦與斑節蝦之後,成為台灣成功養殖海水蝦種。在水產養殖的產業中,飼料是佔生產總成本的最大宗,約佔40 - 60%,由於水產生物對蛋白質的需求高,蛋白質成為水產人工配合飼料主要成本,因此,如何在不影響水產生物成長與健康的原則下,使用較為便宜的蛋白質源使降低飼料成本,增加水產養殖效益的重要方法。魚粉為水產養殖飼料中主要的蛋白質來源,由於自然環境的變遷,海洋資源過度的開發及污染等問題,造成漁業資源枯竭,加上水產養殖產業的不斷擴增,使得魚粉的產量日漸短缺,造成價格攀升,增加水產養殖的生產成本,因此尋求其他蛋白質來源是刻不容緩的重要課題。近十年來,學者嘗試將羽扇豆(Lupinus sp.)做為水產飼料之蛋白質源,已有研究指出扇豆可以取代水產生物飼料中之部分魚粉,餵飼虹鱒(Burel et al.,1998; Bangoula et al., 1993; Hughes 1991; Moyano et al., 1992)、gilthead seabream(Robaina et al., 1995)、草蝦(Sudaryono et al., 1999)、turbot(Burel et al., 2000)、鮭魚(Carter and Hauler, 2000)、吳郭魚(陳, 2001)而不影響其成長。黃豆之蛋白質含量達40%-48%,其價格低廉及供應量穩定,胺基酸組成除缺乏甲硫胺酸外大致平衡,是重要的植物性蛋白源,但在水產飼料上之應用仍有一些限制,除必需胺基酸中甲硫胺酸缺乏外,對某些魚類,其嗜口性低,且存在黃豆內抗營養因子會影響魚類對食物之利用及響健康與成長,例如植酸會與二價或三價的金屬離子及蛋白質結合導致礦物質和蛋白質利用率下降,胰蛋白酶抑制劑會導致對蛋白質之利用率下降 (Francis et al., 2001)。為克服這些問題,可於飼料中添加甲硫胺酸或添加富含甲硫胺酸的原料以維持飼料中胺基酸的平衡;添加誘引劑增加飼料之嗜口性;添加植酸酶去除植酸的影響;提高特定礦物質元素以及飼料製程中以加熱方式破壞胰蛋白酶抑制劑的活性。經不同處理之黃豆產品已廣泛的應用在飼料製作中。
1. 去脂豆粉:俗稱黃豆粕,為一般常用的豆粉,為黃豆去脂後的產品,含粗蛋白質約43.32%,粗脂肪約2.24%,粗灰分約6.48%。海水魚中,豆粉可取代金頭海鯛(Sparus aurata)飼料中魚粉蛋白達20%,而不會影響金頭海鯛之增重率、飼料轉換率及蛋白質利用率 (Robaina et al., 1995) ; 在歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax) 的飼料中,豆粉可取代飼料中魚粉蛋白達25%,而不會影響魚類成長 (Lanari et al., 1998)。
2. 濃縮黃豆蛋白:為去脂豆粉經化學處理,保留蛋白質但移去特定碳水化合物與礦物質及部分抗營養因子。粗蛋白質約64.54%,粗脂肪0.77%,粗灰分約7.57%。在魚類飼料應用方面,濃縮黃豆蛋白可取代魚粉達40-100% (Li,2002):於以黃豆蛋白完全取代魚粉之虹鱒(Oncorhynchus mykiss) 飼料中補足甲硫胺酸,顯現該飼料不會影響到虹鱒的成長(Kaushik et al., 1995)。鮭魚(Salmo salar)飼料的研究中,黃豆蛋白可取代魚粉蛋白達75%,而不會影響於成長(Storebakken et al., 1998);鯉魚(Cyprinus carpio)飼料的研究顯示,黃豆蛋白可取代魚粉蛋白40%,而不會影響李於成長(Escaffre et al., 1997)。
3. 去抗營養因子豆粉:經酵素處理掉去抗營養因子的黃豆粉,含粗蛋白質約48.59%,粗脂肪約0.37%,粗灰分7.09%。在鮭魚飼料中,豆粉取代魚粉之比率可達40%,去營養因子豆粉組和魚粉組有相似的成長,且比去脂豆粉之成長促進效果還要好(Refstie et al., 1998)。
4. 去脂發酵豆粉:豆粉經Bacillus amyloliquefacins 發酵處理,發酵過程可分解飼料中蛋白質及澱粉,幫助動物營養之吸收。成分含粗蛋白質約49.43%,粗脂肪約0.25%,粗灰分10.59%;在發酵作用中,酵母菌及乳酸菌會產生植酸酶分解穀類之植酸進而提高礦物質利用率(Francis et al., 2001) 。在甲魚(Trionyxsinensis)飼料之研究中發現,發酵豆粉取代飼料中魚粉比率達13.1%時,並不會影響甲魚之成長(Huang, 1999)。其他發酵榖物應用於水產飼料之研究,包括:發酵玉米可提升玉米蛋白中離胺酸及甲硫胺酸含量(Wang and Fields,1978);在大西洋鮭魚(Salmosalar L.)飼料之研究中,發酵的小麥及大麥取代飼料中魚粉蛋白可以改善大西洋鮭魚對鋅的吸收(Skrede et al., 2002)。蝦類不具有免疫球蛋白及免疫記憶性,免疫系統以非特異性免疫為主,以防禦蝦體受病原感染。參與此反應包含體液性(humoral)及細胞性 (cellular)免疫(Takahashi et al., 1995)。就體液性防禦機制而言:甲殼類的血淋巴中已有多種體液性的防禦機制被証明,如沉澱素 (precipitins) (Stewart & Foley, 1969)、殺菌素(bactericidins) (Stewart & Zwicker, 1972; Mori & Stewart, 1978)、凝集素(agglutinins or lectins) (Hall & Rowland, 1974; Ogata et al., 1983; Ravindranath &Paulson, 1988; Ratanapo & Chulavatnatol, 1990; Kopacek et al., 1993)、調理素(opsonins)、誘發性抗微生物 peptides (inducible antimicro- bial peptides) 及抗病毒因子(antiviral factors)、血球凝集素(hemagglutinin)等。細胞性免疫包括吞噬作用(phagocytosis)、包膜作用 (encapsulation)、凝固作用 (coagulation)、酚氧化酵素系統 (phenoloxidase, PO),反應氧族群 (reactive oxygen intermediates, ROIs)、細胞毒殺作用 (cytotoxicity)等 (Johansson and Söderhäll, 1989)。就細胞性免疫防禦機制而言, 血球型及其功能為:

(1) 透明血球為典型的吞噬細胞,缺乏酚氧化酵素活性。吞噬作用不受外來物如 β-1,3-glucans (βG) 及脂多醣(lipopolysaccharides,LPS) 的影響,但吞噬活性受原酚氧化酵素 (proPO) 系統活化的物質刺激而增強;

(2)半顆粒血球僅含有少量的proPO及微弱的吞噬作用,其受外來物質的作用而釋出胞內顆粒,在proPO系統活化的物質作用下造成血球溶解破裂。在淡水螯蝦 (Astacus leptodactylus) 半顆粒血球具有包膜作用(encapsulation) 的重要功能;

(3) 顆粒血球具有多量的proPO系統活化的物質及proPO,但proPO不受LPS及βG的刺激而釋出,須藉由其它活化因子如聚葡萄糖結合蛋白 (β-1,3-glucans biding protein,βGP)及76 kD蛋白質的作用而釋放。該細胞血球具有微弱的包作用 (Johansson and Söderhäll, 1989;Söderhäll andCerenius, 1992)。原酚氧化酵素系統中之peroxinectin,存在顆粒血球及半顆粒血球中,隨proPO 系統而釋出並活化 (Holmblad 和Söderhäll, 1999) 。peroxinectin 屬於heme-containing peroxidases (Johansson et al., 1995),它釋出後可被LPS及β-glucan活化而持續擴大proPO系統的活性、促進顆粒血球與半顆粒血球顆粒的去顆粒化(degradulation) (Holmblad and Söderhäll, 1999)、增加附著 (attachment) (Johanssonand Söderhäll, 1988)、擴張 (spreading)及聚集作用 (aggregation)、調理 (opsonin)(Thörnqvist et al., 1994) 以及過氧化氫酵素(peroxidase)活性。此外,peroxinectin也可促進半顆粒血球的包膜作用(encapsulation) (Kobayashi et al., 1990)、被預測可能與透明血球的吞噬作用有關 (Söderhäll and Cerenius, 1992)。酚氧化酵素是原酚氧化酵素系統反應最終酵素,其活性通常被作為蝦類免疫能力之指標。吞噬作用是無脊椎動物清除外來異物重要的細胞性防禦 (Bayne, 1990),異物或微生物被吞噬進入細胞後便會行成消化液泡此稱為吞噬胞 (phagosome)。當吞噬細胞要消除被吞噬的異物會引發耗氧上升反應,以合成具有殺菌潛能的ROIs,包括O2-、H2O2、HOCl-、OH-等含氧自由基,此等自由基之產生系經由NADPH、SOD、catalase等酵素作用產生。然過量的氧化物產生,雖具有強烈的殺菌能力,同樣的也會對宿主造成傷害 (Cheng and Wang, 2001),因此抗氧化酵素,如超氧歧化酵素 (superoxide dismutase)、催化酵素 (catalase)、過氧化酵素 (peroxidase)的即時活化,將過量的氧化物去除,對於宿主是一種保護的機制。蝦類為變溫動物,環境因素對緊迫及免疫生理影響甚大。免疫機能的指標包括,總血球數,抗菌活性 (antibacterial activity)、吞噬作用、ROIs及proPO系統活性 (Le Moullac and Haffner, 2000),而ROIs及PO活性認為可做為甲殼類免疫的重要指標 (Rodríguezand Le Moullac, 2000)。本研究以白蝦為試驗對象,利用達邦蛋白-P為飼料蛋白質來源,適量添加飼料以取代魚粉量,探討:
1. 以不同比率之達邦蛋白-P取代飼料中魚粉對白蝦成長之影響
2. 以不同比率之達邦蛋白-P取代飼料中魚粉對白蝦養殖飼料效率之影響
3. 以不同比率之達邦蛋白-P取代飼料中魚粉對白蝦免疫抗病能力之影響,以總血球數、酚氧化酵素活性、超氧陰離子含量、超氧歧化酵素活性,以及對Vibrioalginolyticus之吞噬活性、清除能力及感受性等蝦類免疫因子做為評估指標。
 

二、材料與方法
1. 試驗蝦與試驗條件
以達邦蛋白-P取代白蝦飼料中之魚粉為0%、5%、7.5%、10%、15%及20%(表一),並利用此不同取代率之飼料餵飼白蝦,每取代組三重複,每重覆放養360尾,飼養密度為30尾/m2。試驗維期兩個月。實驗用南美白蝦取自於屏東縣具防疫設施之室外養殖場。選擇體重約8-9公克之白蝦蓄養於鹽度25‰之海水循環水泥池(4 × 3 公尺)蓄養2星期後進行試驗,蓄養期間每日投餵蝦飼料 (台榮飼料公司) 2次並24小時持續打氣,以高低溫度計每天記錄水溫變動。各組實驗用蝦間之體重、體長及頭胸甲長無顯著差異。蝦體平均體重為9.1 ±克,試驗期間每星期換水三分之一,換水前採水測量水中氨-氮、亞硝酸-氮及磷酸鹽濃度;每兩星期隨機採集—尾白蝦,記錄體長、體重;餵飼後第8週隨機採集各處理組白蝦10隻尾,進行免疫抗病能力評估。此外,亦進行各處理組飼料成份分析。實驗開始時,每日投予試驗用飼料兩次,分別為上午8:30 - 9:30及下午4:00 - 5:00,每日總投餵量為蝦體重之4%,飼養期間水溫為25-27.8 ℃,鹽度為25‰。
2. 實驗飼料製作
試驗用之飼料以台榮飼料公司之白蝦飼料配方為基礎,在總蛋白質量及總能量一致的原則下配製,因此,本研究中所使用之飼料原料須事先進行分析,檢測原料魚粉(智利紅魚粉)中粗蛋白為67.6%、粗脂質含量為6.8%、水份為8.65%、灰份為17.36%,再以達邦蛋白-P取代魚粉蛋白質,取代比例為0、5、7.5、10、15、20%,各組實驗飼料之粗蛋白質、粗脂肪、粗灰份及水分含量在統計上無顯著差異。各試驗組飼料之各成分組成如表一所示。
3.分析方法
3.1. 飼料分析
3.1.1. 水分與灰份含量測定
飼料中之水分與灰份測定,係依據AOAC (1984) 方法分析。水分分析是將樣品 (約1 g) 置於烘箱中,以110 ℃烘乾水分,每隔兩小時秤重,直至所測重量恆定為止,其減少的重量即為水分量,再除以飼料量即為水分比例。灰份分析法則是將樣品 (約0.5 g) 置於灰化爐 (NEY 2-525) 中,600 ℃、15小時,將樣品灰化至呈灰色粉末為止,而後秤重,此灰色粉末重即為灰分重。
3.1.2. 粗蛋白測定
各組飼料蛋白質之含量,依照Micro-Kjeldahl的分析方法 (AOAC,1984) 來分析。取樣品 (飼料約0.2 g) 以90 mm濾紙 (Toyo,Japan) 包覆,放入凱氏氮分解瓶中,加入K2SO4 : CuSO4 = 9 : 1的催化劑3 g,隨後再加入10 ml 18 N的濃硫酸,將凱氏氮分解瓶放入粗蛋白質分解裝置 (Büchi 435),先以210 ℃預熱30分鐘,接著再提高溫度至560 ℃,約二小時之後分解完畢,此時溶液為淡藍綠色且澄清,使其於室溫下冷卻,將此分解完畢的樣品,以凱氏氮自動測定儀 (Büchi 339)測定其硫酸滴定量,再計算樣本中粗蛋白質含量。自動分析裝置使用的溶劑及溶液分別為:30 ml蒸餾水、75 ml氫氧化鈉 (NaOH, 40%)、50 ml硼酸 (H3BO3, 2%)及滴定用硫酸 (H2SO4, 0.1 N)。換算公式如下:粗蛋白(%) = [6.25x 0.1×1.0x 硫酸滴定量(ml) × 14 ÷ 樣本重(mg)] × 100
3.1.3. 粗脂質測定
依Folch et al., (1957)的方法。將樣品 (約1.5 g) 加入氯仿/甲醇 (choloroform/ methanol, 2:1 v/v) 50 ml的溶液中,以均質機 (Nissei AM-3, Tokyo Japan) 5000rpm 攪拌5分鐘,再用 Büchner funnel 過濾,並以氯仿/甲醇 (2:1 v/v) 50 ml洗滌,將過濾液完全移入分液漏斗中,並加入0.03 M氯化鎂 (MgCl2) 20 ml 強力混合1分鐘,置於室溫中一夜,取含脂質之下層液經過濾裝入秤重過之濃縮瓶中,經減壓回轉濃縮機濃縮後,秤瓶重由萃取物重除以樣品重量以計算粗脂質含量。
3.2. 成長與飼料效益分析
將各處理組於採樣時間點之相關記錄,利用下列公式計算:
3.2.1. Weight gain (WG, %) = [body weight gain(g)/ initial body weight(g)]×100
3.2.2. Feed efficiency rate (FE, %) = [body weight gain(g)/ feed intake(g)]x 100
3.2.3. Survival (%) = [final number of fish/ initial number of fish]x 100
3.3. 白蝦免疫因子活性之測定
3.3.1. 總血球數及不同種類血球數之計數方法抽取血淋巴0.1 ml 與0.9 ml 之抗凝劑混合後,置於1.5 ml 之微量離心管中充份混合後,取50 μl 混合稀釋液,利用血球計數板於倒立式位相差顯微鏡下計算總血球數三次,求其平均值。
3.3.2. 血球酚氧化酵素活性之測定
試驗前,所有用於測定酚氧化酵素 (phenoloxidase, PO) 之試藥盛裝玻璃器皿、吸管、微量離心管等用10% HCl 浸泡隔夜,浸泡後各器具以去離子水清洗數次,並滅菌、烘乾後使用,以防止PO 被活化。PO 活性測定方法是修改自Hernández-López et al. (1996)。以25 G 針頭之1ml 針筒,自腹部第一體節插入頭胸甲之血竇 (vential sinus) 抽取血淋巴0.1 ml,再與0.9 ml 預冷之抗凝血劑於1.5 ml 之微量離心管中充份混合後,取0.9 ml 之混合液於4 ℃、300 ×g 下離心15 分鐘,去除上清液再加1 ml 預冷cacodylate-citratebuffer 清洗血球細胞一次再離心,去除上清液後加200 μl 的cacodylate buffer,將血球細胞懸浮其中,取懸浮液100 μl 加入50 μl 的trypsin 溶液作為誘發劑,於室溫下作用10 分鐘,再加入50 μl 的L-DOPA (L-3, 2-dihydroxyphenylalanine, Sigma)溶液作為受質,在室溫下作用5 分鐘,加入800 μl 的cacodylate buffer 後立即以Hitachi U-2001 分光度計(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan) 在波長490 nm 下測其吸光值。控制組依上述方法操作,但誘發劑trypsin 溶液改由50 μl 的cacodylate buffer代替。
3.3.3. 血球 O2-含量測定

試驗前,所有用於測定O2-之盛裝試藥玻璃器皿、吸管、微量離心管等用具皆以10% HCl 浸泡隔夜,浸泡後各器具以去離子水清洗數次後,滅菌、烘乾後使用。血球O2-之測定方法是修改自Song and Hsieh (1994) 所述之Nitrobluetetrazolium (NBT) 染色法。取96 槽平底微量滴定盤,每槽加100 μl 之poly-L-lysine(0.2%, Sigma) 以增加血球吸附槽面,作用30 分鐘後取出,取蝦血淋巴100 μl 加入槽中,以離心機300 ×g 離心15 分鐘,將血球固著於槽底部並去除上清液,加入100 μl 之zymosam 作為誘發組,控制組以MCHBSS 代替誘發劑zymosam溶液,於室溫中作用30 分鐘後,加入100 μl NB(0.3%, Sigma) 於室溫中作用30 分鐘,再加入100%甲醇終止反應,並以70%甲醇沖洗三次,風乾後加入120μl KOH (2M) 及140 μl DMS(dimethylsulfoxide) 混合液以溶解細胞質內的不溶性 Formazan (還原態 NBT),再以ELISA 分析儀(SPECTRAmax190,MolecularDevices) 測量formazan 在630 nm 波長之吸光值。

3.3.4. 血球超氧歧化酵素(SOD)活性測定

超氧歧化酵素的角色就是在氧化能量進行期間,加速有毒超氧自由基的歧化作用以轉為過氧化氫及分子態氧。分析原理乃利用xanthine oxidase (XOD) 產生超氧自由基,再與2-4-iodophenyl-3-4-nitrophenol- 5-phenyltetrazolium chloride反應成紅色formazan dye (red formazan dye)。藉由抑制該反應程度來測定SOD的活性。分析方法利用Ranxsod Kit (Randox)測定,其溶液製備以說明書所示配製。從血竇內抽取200 μl 血淋巴液加入800 μl 抗凝血劑,在4 ℃下664 ×g 離心20 分鐘,去除上清液,以0.85% NaCl 清洗兩次後,將上層液倒除,加入100 μl預冷蒸餾水,在4 ℃下靜置15 分鐘,以脹破血球。再加入PBS (Phosphate buffer,pH = 7) 100 μl,成200 μl 樣本。取已稀釋完全的標準品10 μl ,加入200 μl Mixed substrate,再加入30 μlXanthine oxidaes,使之充份混合,並立即以ELISA 分析儀 (SPECTRAmax 190,Molecular Devices)分析,以30 秒為間隔持續讀取OD505 吸光值至10 分鐘。並求取其斜率 (ΔA /min)。其標準曲線的計算:100 – [std(ΔA /min)×100/ S8(ΔA /min)] = % inhibitionS1 為原液、S2 為原液2 倍稀釋、S3 為原液4 倍稀釋、S4 為原液8 倍稀釋、S5 為原液16 倍稀釋、S6 為原液48 倍稀釋、S7 為原液144 倍稀釋、S8 為去離子水。由上式求得S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8 之inhibition。以inhibition (%)值為Y 軸,標準液之活性 (unit ml-1) 為X 軸,繪出標準曲線。取經前處理之樣本10 μl ,加入200 μl Mixed substrate,再加入30 μl Xanthine oxidaes,使之充份混合,並立即以ELISA 分析儀 (SPECTRAmax 190, Molecular Devices)分析,以30 秒為間隔持續讀取OD505 吸光值至10 分鐘。並求取其斜absorbance variation(ΔA)/ min。將樣本值代入:100-[sample(ΔA /min)×100/ S8(ΔA /min)] = % inhibition求得sample 之inhibition (%),再對照標準曲線得sample 之SOD 活性。
3.3.5. 血球吞噬能力及蝦子清除作用測定
各處理組試驗蝦於餵飼後第二個月進行隨機採樣,各處理組採集之白蝦自頭胸部腹面血竇注射V. alginolyticus。注射完畢後將蝦子分別再放回原處理水中,1.5 小時後抽取血淋巴進行吞噬和清除試驗。使用25 G ×1’’針頭由頭胸部腹面血竇位置採集血淋 (hemolymph),並以滅菌之MAS 以1 : 1 混合,混合後再加入等量1%之paraformaldehyde,於4 ℃下固定30 分鐘。固定後利用血球離心機 (Model Cytopin 3, Shandon, England) 113 ×g離心3 分鐘,讓血球吸附在載玻片上。離心後施以劉氏染色 (Liu stain),後以PBS水洗二次,染色完成之血球玻片置於光學顯微鏡下觀察,每隻蝦子各觀察200 個血球細胞,統計具有吞噬細菌之血球數比率,吞噬率 (phagocytosis rate, PR) 之計算方式如下:= ×100Total haemocytesPR Phagocytic hemocytes清除效率的試驗方式修改自Adams (1991)。取血淋巴樣本稀釋200 倍之菌液0.05 ml 塗抹在TSA 上,並於30 ℃下培養24 小時後計算菌落數,並換算出感染後不同時間的蝦子血淋巴夜中的細菌濃度。Percentage inhibition (PI) 計算方式如下:=100− ×100Meanof CFUin controlgroupPI Meanof CFUin testedgroup
3.3.6. 攻擊試驗
各處理組於餵飼後第二個月進行隨機採樣,並以V. alginolyticus 進行攻擊試驗。每組為三重覆,每重覆為10 隻蝦。每隻蝦注射20 μl 的病原懸濁液,使每隻蝦子感染量一致,菌量為2×104 cfu shrimp-1,攻擊感染之蝦隻立即放入裝有40公升25‰海水之FRP 桶中觀察死亡狀況。控制組則注射20 μl 之生理食鹽水代替菌液,試驗期間持續餵食並每日換試驗水一次,每12 小時記錄死亡時間及數量,試驗觀察7 天。
3.4. 統計分析
利用SAS (statistical analysis system)套裝軟體 (SAS, 1988),以單向變異分析及鄧肯氏多變域測驗 (Duncan’s multiple range test) (Duncan, 1955) 統計分析各項測定值,以瞭解試驗組間之是否有顯著差異,顯著水準設定為p < 0.05。
 

三、結果與討論
本研究以達邦蛋白-P取代0%、5%、7.5%、10%、15%、20%魚粉,作為養殖白蝦飼料蛋白質來源,使得達邦蛋白-P在蝦飼料中之含有量分別為0%、2.5%、3.7%、4.9%、7.3%、9.8%,以此飼料餵飼白蝦評估其對白蝦成長、飼料效益及免疫抗病能力之影響。結果顯示,以不同濃度達邦蛋白-P取代魚粉之飼料餵飼白蝦8週後,達邦蛋白-P取代魚粉5%及10%組明顯高於未添加達邦蛋白-P之控制組,其他取代組雖在統計上沒有明顯高於控制組,但卻有些微之增加(Fig. 1)。血球除具有免疫功能外,也被認為具有儲藏與運送營養素之功能,因此,本研究白蝦餵飼達邦蛋白飼料後,導致總血球增加可能與蝦類增強營養之運送及儲藏有關。血球酚氧化酵素活性檢測結果發現,添加達邦蛋白-P各組之酚氧化酵素活性與未添加之控制組沒有差異(Fig. 2),顯現添加達邦蛋白-P不會影響免疫因子酚氧化酵素活性。蝦類血球的吞噬作用活性在對抗入侵病原上扮演重要的角色,其中,血球呼吸爆(O2-含量)是血球吞噬作用後產生用以殺菌之物質,適當的提高其含量表示抗病力增強,而O2-也會造成血球細胞之傷害,故須仰賴如超氧歧化酵素之類的抗氧化酶進行快速消除。白蝦血球產生O2-量隨著餵飼達邦蛋白-P含量的增加而降低,添加至10%量達最低,隨之漸升高,相反的趨勢出現在超氧歧化酵素活性的表現,白蝦飼料中以達邦蛋白-P取代7.5%~15%具有增加血球超氧歧化酵素活性現象(Fig. 3)。顯現白蝦餵飼達邦蛋白-P不會影響血球反應氧族群 (reactiveoxygen intermediates, ROIs)系統的調節。Vibrio alginolyticus是白蝦養殖常見之病原菌,將其感染經餵飼不同比率達邦蛋白-P取代魚粉飼料56天之白蝦,觀察白蝦對病原菌之吞噬能力、清除效率,及對病原感染之感受性。吞噬能力及清除效率的結果如Fig. 4所示。當白蝦餵飼達邦蛋白-P取代魚粉達5%和7.5%之飼料,其清除效率明顯高於未添加之控制組,添加量達20%未見與控制組有任何差異。在吞噬能力的表現上,雖然20%添加組較控制組明顯降低,但在清除能力上卻稍為叫控制組升高。進一步與攻擊感染試驗之存活率進行比對,可以發現適量添加達邦蛋白-P(5~15%)可以稍微增強白蝦抗病能力,添加達20%則與控制組無顯著差異(Fig. 5)。Chiu et al.(2007)指出白蝦餵飼每公斤含Lactobacillus plantarum1010 cfu之飼料顯著增加白蝦免疫抗病力。適量添加可以增加免疫抗病力可能與達邦蛋白發酵乾燥後所殘存的發酵菌或死亡菌體刺激免疫能力有關。而添加達20%沒有增強免疫抗病力,可能是因為取代之達邦蛋白-P中胺基酸不夠均衡,導致營養不足所致,如能在配製飼料過程中再增加達邦蛋白-P所不足之胺基酸含量,將可再提升取代量。優良水質是白蝦養殖成功的重要條件。含氮廢物是主要影響水產動物水質因子,而水中含氮廢物包括:氨-氮、亞硝酸-氮與硝酸-氮,其主要來源為:水產動物代謝產生,水產動物所產生之含氮廢物約90%為氨-氮,另外,氨-氮也來自水中有機物質分解產生。高濃度的氨-氮會毒害水生生物或影響水產動物之生理與免疫機能。氨-氮在有氧的情況下經硝化菌的硝化作用產生亞硝酸,最終形成毒害較低之硝酸-氮。Lin and Chen (2001)指出,白蝦暴露在含氨氮水體之第24小時和第96小時半致死濃度分別為68.75與39.54 mg l-1;亞硝酸氮則為521和322 mgl-1 (Lin and Chen, 2001)。本研究進行期間,定期監測水體氨-氮及亞硝酸-氮的濃度,結果發現,試驗期間的氨氮濃度低於1 mg l-1(Fig. 6A),且亞硝酸氮濃度低於15 mg l-1(Fig. 6B),顯示,試驗期間含氮廢物量不會影響試驗結果。以達邦蛋白-P取代白蝦飼料中魚粉達10%以上各組在餵飼4週後,水中亞硝酸-氮之含量明顯低於控制組及5%、7.5%組,顯現化作用增強,此現象是否與達邦蛋白-P產品中所含殘存活菌具有硝化作用細菌有關。另外,磷酸鹽會隨養殖期間增加而漸漸累積,且各組間無明顯差異。本試驗中,以達邦蛋白-P取代魚粉飼料餵飼白蝦,經過56天,白蝦存活率在88.9-94.4%,各處理組間無明顯差異(Fig. 7),顯示達邦蛋白-P取代魚粉達20%不會影響養成活存率。Suárez et al. (2009) 利用大豆和菜籽油取代飼料中魚粉,評估其對白蝦成長之影響,結果顯示,在各取代魚粉處理組間並無顯著差異,飼料轉換係數位於1.84-2.02間。白蝦以不同比例達邦蛋白-P取代魚粉飼料餵飼,其飼料轉換係數介於2.58~3.36間(Fig. 8)。兩相比較,本研究具有較高之換肉係數,這可能與試驗蝦之大小不同有關,Suárez et al. (2009)使用之蝦體重為0.3克,而本試驗為9克。本試驗各組間之換肉係數以取代率達10~15%最低,表示具有較佳之飼料效率,而達20%則與控制組沒有差異;在增重與體長上,取代率10~15%組明顯較高(Fig. 9、10),顯現有較佳的成長。於若以飼料產業降低飼料成本為主要考量,達邦蛋白-P取代魚粉達20%不會影響白蝦養殖效益。以達邦蛋白-P取代白蝦飼料中的魚粉,不會減弱白蝦的免疫抗病能力,甚至在取代5%和10%的處理組別發現免疫提升的效果。再者,在各項飼料效益分析上,達邦蛋白-P的添加並不會影響各項飼料效益結果,其中,在取代10~15%處理組別更有提升飼料換肉率的效果,且10%以上添加量可以增加水中硝化作用,降低水中亞硝酸-氮含量。若以不影響養殖成效並降低飼料成本考量,本研究結果之建議取代量可達20%魚粉,即白蝦飼料中可添加達邦蛋白-P達10%左右。
四、參考文獻
中華民國台灣地區漁業統計年報,2007。行政院農業委員會漁業署。陳佳珍,2001。飼料中添加羽扇豆粉及類胰島素成長因子對吳郭魚成長效果之研究。國立台灣大學漁業科學研究所碩士論文。
表一、以達邦蛋白-P 取代魚粉添加飼料試驗之各組別飼料配方

試驗組別 0% 5% 7.5% 10% 15% 20%
達邦蛋白-P(CP:52%) 0 % 5 % 7.5 % 10 % 15 % 20 %
取代魚粉百分比魚粉(智利紅魚粉CP:67.6%) 37.5 % 35.625 % 34.688 % 33.75 % 31.875 % 30.0 %
達邦蛋白 0 % 2.476 % 3.656 % 4.875 % 7.313 % 9.75 %
魚油 0 % 0.128 % 0.191 % 0.255 % 0.383 % 0.51 %
黃豆油 0.078 % 0.058 % 0.049 % 0.039 % 0.019 % 0 %
纖維素 2.922 % 2.213 % 1.916 % 1.581 % 0.91 % 0.24 %
基礎原料 59.5 % 59.5 % 59.5 % 59.5 % 59.5 % 59.5 %


表二、各試驗組飼料之粗成份
組別
成份 0% 5% 7.5% 10% 15% 20%
粗蛋白(%) 44.73±0.19 45.05±0.07 44.85±0.05 44.69±0.09 44.41±0.02 44.63±0.02
粗灰份(%) 15.11±0.02 14.98±0.06 14.83±0.07 14.72±0.02 14.62±0.13 14.48±0.00
粗脂肪(%) 5.79±0.07 5.83±0.06 5.79±0.00 6.07±0.03 6.06±0.10 5.87±0.04
水份(%) 4.69±0.03 4.80±0.04 4.75±0.08 4.71±0.07 4.65±0.01 4.98±0.03
15 0 1 2 3 4 5
Total haemocyte count (x106 ml-1)caabc abbc bc0% 5% 7.5% 10% 15% 20%Fig.

1. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料第42 天及第56 天,各取代百分比組別白蝦總血球數之變動情形。

2. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料第42 天及第56 天,各取代百分比組別白蝦酚氧化酵素活性之變動情形。

3. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料第42 天及第56 天,各取代百分比組別白蝦超氧歧化酵素活性(A)及超氧離子含量(B)之變動情形。

4. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料56 天後,各取代百分比組別白蝦以Vibrio alginolyticus 進行感染後之吞噬活性及清除效率變動情

5. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料56 天後,各取代百分比組別白蝦以Vibrio alginolyticus 進行感染後之存活率變動情形。

6. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料後,養殖水體中氨氮(A)、亞硝酸氮(B)及磷酸鹽(C)濃度變動情形。

7. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料八週期間,各取代百分比組別白蝦存活率之變動情形。

8. 白蝦餵飼達邦蛋白-P取代魚粉飼料八週後,飼料轉換率(FCR)於各取代百分比之變動情形。方框下限為白蝦全數存活之理想轉換率,方框上限為扣除中間採樣數後之實際存活率所得之轉換率;中央垂直縱線表示該轉換率之平均標準誤(SEM)。由數據顯示,15%取代百分比具有最佳之飼料轉換率,其方框之上下限高度最短,亦代表存活率最佳。

9. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料八週後,飼料換肉率於各取代百分比之變動情形。

10. 白蝦餵飼達邦蛋白-P 取代魚粉飼料第0、2、4、6 及8 周,各取代百分比組別白蝦體重(A)及體長(B)之變動情形。

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