陈新风 郭荣富
酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides,CPP）是以牛奶酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分离纯化后得到的含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性肽（Nicholas，1997）。它是多种长度不同的短肽混合物，主要分布于αs1-、αs2-和β-酪蛋白等牛乳蛋白的不同区域，周杏琴等（2002）利用反向高效液相制备色谱分离出4种不同组分的CPP，并确定了其中3种的分子结构。CPP的核心部位由3个磷酸丝氨酸残基组成一个-Ser（P）-残基簇，后面紧接着2个-G1u-残基组成的。CPP具有很强的促钙以及其它矿物元素吸收的活性,这是由于CPP的核心部位可以与钙以及铁、镁等二价和某些三价矿物离子结合，同时也可以阻止CPP的进一步水解（Kasai，1992）。
1 酪蛋白磷酸肽的生理功能及其作用机理
1.1 促进肠道对钙、铁和锌等矿物质的吸收
除了在pH值为4.0时CPP溶解度为90%，pH在2.0～10.0时均高于90%（牟光庆等，2003），所以，CPP可以在小肠的中性或碱性环境中使钙保持溶解状态，并促进肠壁对钙的吸收，因此被称为促钙吸收因子（Nicholas，1996；Xie，1997）。Reeve等(1958)从酪蛋白的水解产物分离到的CPP进行动物体外试验发现，CPP可以在中性和偏碱性条件下阻止钙的沉淀，从而促进小肠对钙的吸收。Hiroshi(1993)在研究乳铁蛋白对铁的吸收影响时，对CPP促进铁吸收也进行了研究，发现在pH值7.5碳酸氢钠或磷酸钠缓冲溶液中，调节pH值6.5～7.4时，CPP能明显增强铁的溶解度和吸收率。牟光庆（2001）对贫血大鼠的研究证实，0.1%CPP和FeSO4同时添加的效果优于单独添加FeSO4，缺铁性贫血大鼠的血红蛋白、红细胞数及血细胞压积的影响比缺铁性饲料喂大鼠的血液生化指标有显著影响，且缺铁性贫血的大鼠血液生化指标恢复良好，从而推断CPP可促进铁的吸收利用。
许多研究证实，CPP促进钙质吸收方式有两种：一种是在十二指肠的上端，在VD的存在下，可促使钙以主动方式吸收；另外一种是在回肠及其末端以被动方式吸收，它与前者不同，不直接受到机体功能、营养状况、年龄等影响。CPP促进钙的吸收以后一种方式为主。
CPP促进矿物质吸收的机理是： CPP带有较多负电荷，既可以抵抗消化道中各种酶的水解，又可以通过磷酸丝氨酰与钙、铁等离子螯合形成可溶物，从而有效地防止溶解的金属离子在小肠中性或偏碱环境中与磷酸根结合、形成磷酸盐沉淀，同时它还可以有效地增加矿物质在体内的滞留时间。CPP与金属离子的螯合物被肠黏膜吸收后再释放出CPP。CPP抑制磷酸盐沉淀的机理是：磷酸盐在初始形成时是无定形的，之后逐渐转变成晶体形式，CPP黏附于晶体表面，从而阻止晶体增长。但是CPP不能使已形成的磷酸盐沉淀溶解。
1.2 抗龋齿，促进牙齿、骨骼中钙的沉积和钙化
CPP促进钙的沉积和钙化的原因一般认为是它在提高钙的吸收利用的同时，减少了破骨细胞的作用、抑制了骨的再吸收。CPP能提高铁、锌、镁等元素的生物利用率，并具有预防龋齿的功能，可用于防止和治疗牙结石（Fitz Gerald，1998）。Reynolds（1993）发现乳酪中含有的CPP可以将食物中的钙离子以非结晶形式结合在龋齿处，磷酸丝氨酸的钙盐提供自由的钙离子和磷酸根离子缓冲，减少了釉质的脱矿，增强其再矿化，从而有效地防止牙蚀细菌的侵蚀，达到抗龋齿的作用。Mellander（1950）报道，CPP在没有VD参与的情况下可促进钙的吸收，并发现患有佝偻病的小孩服用酪蛋白的胰酶消化液可以强化骨骼的钙化。Sato等(1986)用含有CPP的食物饲喂大鼠，并用同位素标记食物中的钙，发现CPP可明显促进放射性标记的钙在大鼠股骨组织中沉积。张亚非等（1994）报道，在大鼠基础日粮和低钙饲料中分别加入0.5%和0.2%CPP，发现大鼠股骨宽度及股骨指数增加，钙吸收和存留率比对照组高5.13%和6.08%。
1.3 提高繁殖机能和增强机体免疫力
通过对牛、猪体外试验表明，CPP可明显促进精子进入卵细胞的能力和体外精卵细胞的融合，从而提高精子和卵细胞的受精率（Nagai，1996；Mori，1996）。原因是CPP促进精子对钙离子的吸收，增强精子顶体的反应能力，提高精子对卵细胞的穿透能力。此外，Kreysing(1997)在BO的介质中，使牛的成熟卵母细胞在体外受精，结果添加与不添加CPP的精子的穿透率分别为43.9%和20.7%，多精入卵率分别是5.2%和2.9%，分裂率分别为41%和25%，发育成胚泡的为13%和6%。如果CPP去磷酸化，则不能促进钙离子被公猪精子吸收、降低精子进入母猪卵细胞的能力（Nagai，1994）。CPP还具有增强动物机体免疫力的功能。Perich等（1992）发现αs1-f(59-79)酪蛋白C端的磷酸基团对抗体的识别具有极高的临界点。Otani等（2000a）研究表明，在大鼠饲料中添加CPP能提高血清中IgG、IgA等抗体的水平，使肠道内的抗原特异性IgA和总IgA得到显著提高，这些说明CPP对黏膜免疫力的提高也有很大的促进作用。
2 酪蛋白磷酸肽的检测以及评定
目前，CPP主要是使用高效液相色谱(HPLC)（Masao,1992）或高效毛细管区带电泳(HPCE)（车发云等，1997；王利民，2001；牟光庆等，2002）进行分离和检测，并结合末端氨基酸分析技术以确定各种磷酸肽的一级结构。Lise lemieux等（1990）将分子筛色谱与反相HPLC联用，成功分离并鉴定多种CPP。但是它们的缺点是仪器、设备和试剂昂贵，操作复杂。庞广昌等（2001）对直接定磷法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IFE）法进行比较，认为这3种方法均可对CPP进行定量测定，分别适用于产量测定，组分测定和较精确测定。
CPP产品的氮/磷摩尔比（N/P）能较客观地反映CPP产品的纯度、磷酸基密度、结合钙能力等理化性质，是其生物学活性的重要指标之一，商业上根据此比值将CPP产品分为CPPⅠ、CPPⅡ和CPPⅢ3类，而市售的CPP主要是后面2种。CPP产品的种类及其规格如表1（朱迅涛，1996；于江虹，1996；陈亚非等，2003）：

陈亚非等（2003）对2种市售CPP在体外结合钙离子能力进行比较发现，在弱碱性溶液中能有效抑制和延缓磷酸钙沉淀的产生，且相同条件下，纯度高，N/P值低的CPP产品持钙能力越强。一般总氮含量用（半微量）凯氏定氮法测定，总磷的测定采用Morrison的快速、微量定磷法。
3 酪蛋白磷酸肽的制备
目前工业制备CPP的方法主要有钙—乙醇沉淀法、膜分离法和离子交换法3种（汤亚杰，1998），而生产过程可分为酪蛋白的水解和CPP的分离两步。
钙—乙醇沉淀法工艺路线：酪蛋白→胰蛋白酶水解（Ph-stat法检测水解度）→酪蛋白水解液→钙—乙醇沉淀→分离→干燥→CPP产品。
膜分离法生产CPP的工艺路线：酪蛋白→酪蛋白水解液→过滤→分离→喷雾干燥→CPP产品。
根据对酪蛋白水解后的产物所采取的不同处理方法，将分离分为4种，即不经过分离处理、钙—乙醇沉淀后过滤、膜过滤和离子交换树脂纯化。然后进行喷雾干燥得到CPP产品。
焦宇知等（2004）采用Alcalase水解酪蛋白并运用纳滤技术生产CPP，与钙—乙醇沉淀工艺进行比较的结果显示：在最佳反应条件下，Alcalase对酪蛋白水解能力比胰蛋白酶强4%～8%，而且Alcalase比胰蛋白酶便宜；TNBS法替代Ph-stat法监测酪蛋白水解，提高了准确度，也可明显降低CPP产品中的灰分含量。此方法生产的CPP在体外的功能试验表明，CPP可阻止亚铁离子的沉淀，钙结合能力随着样品中氮与磷的摩尔比的降低而增大，磷酸基的密度是CPP样品结合钙能力的关键指标之一。
王隽等（2004）研究结果表明复合酶比单酶水解度大，可以提高底物的利用率，水解速率增大。并且认为生产中采用单一酶水解时水解度低，酶消耗量大，底物浪费，CPP成本高。所以筛选合适的复合酶系、确定合适的酶促反应条件，以及分离方法的改进或结合是今后CPP生产的发展方向。
4 影响酪蛋白磷酸肽作用的因素
4.1 CPP中的N/P
CPP的生物活性大小取决于分子中氨基酸组成和排列顺序或磷酸基的分布。CPP中氮和磷的摩尔比（N/P）反应了CPP的纯度和磷酸基密度，当N/P较小时，则纯度较高或磷酸基密度较大，结合钙的能力也强。但是，这种比例不是越低越好，因为磷酸丝氨酰可结合的钙量几乎和它本身等当量，而每个CPP分子使钙溶解的量远超过CPP分子中磷酸丝氨酰的量，即磷酸丝氨酸以外的氨基酸残基对CPP的功能性质也起着一定的作用（冯凤琴等，1997a）。另外， N/P不可能太小，因为从酪蛋白与酶的水解物中分离纯化出来CPP分子中成簇存在的磷酸基在反应的pH条件下带负电荷，可阻止酶的进一步作用。
4.2 CPP的添加量
如果CPP过量，不但不能增加矿物质的吸收，反而会产生抑制作用。Bennett等（2000）分别给大鼠饲喂CPP/Ca为40～100的单一饲粮组和无蛋白单一饲粮组，结果试验组会降低小肠对钙的吸收。其原因可能是过量的CPP与钙离子螯合形成一种可以隐藏钙离子的分子量更大的复合物，减少了钙离子的释放，从而降低了生物利用率。
4.3 温度、pH值、Ca/P以及CPP/Ca
在体外进行的功能性研究发现，CPP与钙的结合量随温度的升高而减少，随pH值的升高而增加；对阻止磷酸钙沉淀的作用随温度升高和溶液Ca/P的增加而下降；随氮磷摩尔比降低，CPP阻止磷酸钙沉淀形成的最低有效浓度下降，而对于CPP中不同的钙磷比，如果Ca/P越大，CPP的氮磷摩尔比越小，保持在溶液中的钙量越多，但每摩尔磷保持钙的摩尔数随氮磷摩尔比的降低而降低（王瑛瑶等，2001）。Daniela（2002）发现，CPP/Ca的比值在5～15之间可促进钙的吸收，并且在浓度比为12时，CPP促进钙吸收的作用最显著，而当比值为20时，对Ca的吸收具有一定的抑制作用。
5 酪蛋白磷酸肽的安全性及其在动物生产中的应用
5.1 安全性
对于CPP的安全性，谢玮等（2003）对小鼠的研究证明，CPP属于实际无毒物质（Ames），对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验说明该物质不具有遗传毒性作用，作为添加剂直接加入食品中食用是安全可靠的，而且对提高钙的吸收和贮留率具有显著的促进作用。所以，由牛乳酪蛋白为原料生产的CPP，作为食品或饲料添加剂不存在安全性问题，容易被人们接受。
5.2 CPP在动物生产中的应用
CPP主要是作为一种促进矿物质离子吸收的功能性饲料添加剂在动物生产中的应用。Mykkanen等（1980）在正常鸡和佝偻病鸡上进行了钙吸收和利用试验，结果表明，CPP能促进钙的吸收和利用。在蛋鸡日粮中添加CPP，可以促进矿物元素尤其是钙的吸收，增强蛋鸡的体质，减少蛋鸡腿病的发生，增加蛋壳硬度，降低破蛋率。Ashida等(1996)试验证明，在正常钙水平日粮中添加CPP可增强蛋鸡骨骼的强度，在低钙日粮中添加0.5%～1.0%的CPP可改善蛋壳的品质。
在仔猪日粮中添加CPP，可促进铁的吸收，防止营养性缺铁贫血，并能显著性提高仔猪血清中的IgG、IgA、IgM等抗体水平，从而增强仔猪的免疫力。Otani等（2000b）给3周龄仔猪每千克日粮添加5g的CPP，经过5周饲养，发现对体增重无明显影响，但是提高了血清和粪便中IgG和IgM的水平，对乳球蛋白特异的IgA比对照组要高得多。Kitamura(2002)在产前两个月至断奶给怀孕母猪补充CPP，粪中IgA和血清IgG明显提高，产仔时乳中IgA和IgG有所提高，仔猪达到110kg需要186d，而对照组需198d。此外，在种猪日粮中添加CPP，能显著提高卵细胞的受精率，提高种畜繁殖性能。对怀孕母畜及其它种用家畜，CPP还可用来防止其它常量、微量矿物元素如镁、锌、锰、铜、钴的缺乏。
总之，随着生产工艺的日益先进，CPP的成本将逐渐降低，动物生产上CPP的应用将越来越广泛，但是通过合理有效地使用CPP如合理的添加方式、适宜的添加量等来促进动物对钙、铁等矿物质的吸收，满足畜禽的需要以及防治相应的缺乏症还需要人们进一步研究。
（参考文献37篇，刊略，需者可函索）
陈新风，云南农业大学动物营养重点实验室，650201，云南昆明。
郭荣富，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2005-01-22