酪蛋白磷酸肽的制备及其性质王俊1，黄文2，乔宇2(1.湖北省农业科学院辐照加工研究所，湖北武汉430064）(2.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070) 摘 要 采用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白，可释放出能促进钙吸收的物质酪蛋白磷酸肽(CPPS)。研究了胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白的条件对CPPS得率的影响，并采用大孔强碱性阴离子交换树脂对CPPS进行纯化，分析了洗脱条件对纯化效果的影响结果表明：水解温度、水解时间、pH值、底物浓度都对CPPS得率有明显的影响。其中水解温度对CPPS得率的影响最大，其次是水解时间、PH值，再次是底物浓度。最佳的水解条件为：底物浓度5%,pH值7.5，水解时间2.5 h，水解温度60℃，加酶量13.16 U/g。最佳的洗脱条件为：进样浓度5%，进样量I0g，进样速度1 d/s，洗脱速度为1.5 d/2 s，进样pH值5.5,洗脱液为浓度0.2 mol/L HCL。在最佳条件下每100g酪蛋白可制得18.8gCPPs，其r( N/P)为5.67。 关键词 牛乳酪蛋白；酪蛋白磷酸肽；胰蛋白酶；离子交换树脂；层析柱我国是钙摄入量严重缺乏的国家之一，寻找有效的补钙途径已成为当前重大的攻关领域[1]。传统钙剂如葡萄糖酸钙、乳酸钙等，服用时需加维生素D，且钙吸收率不高，补钙效果欠佳。为了满足机体对钙的需要，除了食用富含钙的食物外，提高钙的吸收率是最有效的补钙措施。 酪蛋白磷酸肽( Casein Phosphopeptides , CPPs)是以牛乳酪蛋白为原料，经酶水解、分离、纯化而制得的含有磷酸丝氨酰天然活性肽。在pH值呈中性到弱碱性动物肠道内，能阻止磷酸钙沉淀的产生，从而促进钙的吸收。同时CPPs可与铁、锌等矿物质元素形成可溶性络合物，在保护铁、锌方面也有重要的意义。 目前，生产CPPs的方法由于特异性较差，分离得到的CPPs往往混杂有一定量的非CPPS肽(以下简称为N-CPPs)，产品氮和磷的摩尔比较大，其在体内或体外阻止磷酸钙沉淀的作用较小，使用效果较差。将CPPs初产品进一步纯化处理，对提高产品的质量和档次有极其重要的意义。 笔者探讨了水解条件对酪蛋白磷酸肽得率的影响，得到最佳水解条件。然后在此条件下制备CPPs，并采用大孔强碱性阴离子交换树脂，对酪蛋白磷酸肽初产品进行纯化，收集在280 nm处有吸收峰的部分，经冷冻干燥，得到粉状产品，为酪蛋白磷酸肽的开发利用提供科学依据。 1材料与方法 1.1材料 鲜牛乳由华中农业大学畜牧站提供，牛乳酪蛋白为市售。717型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，为中国医药集团上海化学试剂公司产品，胰蛋白酶(1：250，活力：45000 U/g)为中国医药集团上海化学试剂公司产品。 1.2主要仪器及设备 PHS-3C型酸度计(萧山市分析仪器厂),SBS-100型数控计滴自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)TGL16台式高速冷冻离心机(中国科学院武汉科学仪器厂)，岛津UV-265FW型紫外光栅分光光度计(Shimadzu Co.Japan),752型紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂),50cmx2cm层析柱(丰源化学试剂玻璃仪器有限公司)。 1.3实验方法 1.3.1牛乳酪蛋白的制备。用等电点沉淀法从牛乳中提取酪蛋白。牛乳用手摇式牛乳脱脂机(3 000 r/min)离心分离得到脱脂乳。取一定量的脱脂乳于l000ml大烧杯中，将烧杯置于水浴锅加热到40℃，在搅拌下慢慢加入预热到40℃PH值4 .7的醋酸缓冲液，调脱脂乳的PH值至4.7，然后将上述悬浮液冷却至室温，放置5min后过滤，收集沉淀，干燥，即得到酪蛋白[2]。 酪蛋白溶解度的测定：准确称量一定量的酪蛋白，溶解于100ml水中，先称量滤纸的重量，再用滤纸过滤，并烘干过滤后的滤纸，称重，计算酪蛋白的溶解度。 1.3.2酪蛋自磷酸肽的制备及精制。准确称取一定量的酪蛋白溶解于大烧杯中，在水浴中恒温；然后加人一定量的胰蛋白酶溶液混匀并开始计时，每5 min摇晃1次，在水解过程中应当监控pH值的变化，用浓度1mol/L NaOH来调节；保持恒温水解一定时间后，立即置于沸水浴中5min，对酶进行灭活，即得到酶解液。 将以上步骤得到的酶解液调pH值至4.6，6000r/miu。离心约15min，取上清液加10%氯化钙溶液，至终体积浓度为1 .0%，加95%乙醇至终体积分数为50%，离心(6000r/min)，收集沉淀，将沉淀烘干，即得到CPPs。 1.3.3酪蛋白磷酸肽的纯化。 1 .3.3.1大孔强碱性阴离子交换树脂的预处理及装柱。干树脂先用浓度2mol/L NaOH浸泡lh，再用蒸馏水洗到中性，接着用浓度2mol/L HCl浸泡lh，然后用蒸馏水洗到中性，最后再用浓度2mol/L NaOH浸泡lh，用蒸馏水洗到pH值8.0，装柱(50cm ×2cm)。装柱量约为60%-70%。1.3.3.2上样。用蒸馏水将CPPs配制成浓度5%的溶液200ml，并调至pH值8 .0，以1d/s的速度上样。上样结束后，用蒸馏水约500ml，以1 .5d/2s的速度洗涤层析柱，使未被吸附的蛋白质洗脱下来。 1.3.3.3洗脱与收集。用洗脱液洗涤层析柱，洗脱速度为1 .5d/2s，用数控计滴自动部分收集器收集洗脱液，每管收集5ml。在波长280nm下测定和记录每管洗脱液的吸光度。 1.3.4酪蛋自磷酸肽的性质分析。 1.3.4.1酪蛋白磷酸肽的溶解性质分析。准确称量一定的CPPs溶解于100 ml水中，先称量滤纸的重量，再用滤纸过滤，烘于并称量，计算CPPs的溶解度。 1.3.4.2酪蛋白磷酸肽的检测。采用紫外可见记录扫描仪对CPPs液样在200-360 nm进行扫描。 1.4检测内容与方法 水解度用甲醛滴定法测定，洗脱液中蛋白含量用紫外吸收法(测定OD280)测定，总氮含量用微量凯氏定氮法测定，总磷含量按文献[3]分光光度比色法进行测定。计算摩尔氮磷比r(N/P) 2结果与分析 2.1牛乳酪蛋白的溶解度分析 按1.3.1的方法，100 ml牛乳可制得3.3 g酪蛋白。由于酪蛋白中不溶解的部分多为杂质，会影响CPPs制备。酪蛋白的溶解度能反映其含杂质的多少，该实验比较了自制和购买的酪蛋白的溶解度，测得自制酪蛋白溶解度为84.7%，购买的酪蛋白溶解度为96.6%,购买的比自制的酪蛋白溶解度高出11.9%，说明自制的酪蛋白中含较多杂质。 2.2水解条件对酪蛋白磷酸肽得率的影响 酪蛋白磷酸肽的得率受到多种因素的影响，笔者仅研究了水解条件对酪蛋白磷酸肽得率的影响。 2.2.1水解温度对CPPs得率的影响。将酪蛋白在底物浓度5 % , U/S 13 . I6 U/g, pH值7.5，水解时间2.5 h的条件下，分别于20,30,40,50,60,70℃进行水解后制备成CPPs，计算CPPs得率，结果见图1。图1表明，水解温度对CPPs得率有极显著的影响。随着温度的升高，CPPs得率从20℃到60℃逐渐升高，在60℃时达到最高值18.8%，是20℃时的4.6倍，60℃到70℃又迅速下降。分析60℃以后CPPs得率迅速下降的原因是蛋白质、酶在高于60℃时发生变性。根据试验结果与分析，最佳的水解温度是60 ℃。 2.2. 2底物浓度对CPPs得率的影响。将酪蛋白在U/S13.16 U/g, pH值7.5，水解温度60 ℃，水解时间2.5 h的条件下，分别配成浓度为5%,10%,15%进行水解后制备成CPPs ,计算CPPs得率，结果见图2。图2表明，底物浓度对CPPs得率有影响。随着底物浓度的升高，CPPs得率逐渐下降。根据试验结果与分析，最佳的底物浓度为5%。 2.2.3 pH值对CPPs得率的影响。将酪蛋白在底物浓度5 % , U/S 13 .16 U/g，水解温度60 ℃，水解时间2.5 h的条件下，分别在pH值6.5,7.0,7.5,8.0,8.5下进行水解后制备成CPPs，计算CPP，得率，结果见图3。图3表明，pH值对CPPs得率有显著的影响。随pH值的提高,CPPs的得率先增加后降低，pH值为7.5时达到最大值，是pH值为8.5时的1.46倍。根据试验结果与分析，最佳水解pH值为7.5。 2.2.4水解时间对CPPs得率的影响。水解时间是水解过程中一个重要参数，将酪蛋白在底物浓度5% , U/S 13. 16 U/g,pH值7.5，水解温度60℃的条件下，分别水解0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5 h后计算CPPs的得率，结果见图4。图4表明，水解时间对CPPs得率有显著的影响。随水解时间的延长，CPPs得率不断增加，水解时间达到2.5 h后，随着时间的增加CPPs的得率增加不明显。考虑到成本问题，根据试验结果，水解时间选择2.5h较为适宜。 综合以上的结果与分析，采用胰蛋自酶水解酪蛋白的最佳条件为：底物浓度5% , U/S 13 .16 U/g, pH值7.5，水解温度60 ℃，水解时间2.5 h。此时的水解度为12.8%。2.3阴离子树脂纯化CPPs酪蛋白磷酸肽的纯化效果受到多种因素的影响，笔者仅对采用阴离子交换树脂纯化时的洗脱条件进行了研究。用数控计滴自动部分收集器收集洗脱液，每管收集5 ml。在波长280 nm下连续测定和记录每管洗脱液的吸光度，以管数为横坐标，280 nm处的吸光度为纵坐标绘图得洗脱曲线。 洗脱条件①：柱D2cm×50cm，进样浓度5%，进样量10g，进样速度1 d/s，洗脱速度1. 5 d/2 s，进样pH值8.0，洗脱液为浓度0.2mol/L HCl和0.3 mol/L NaCl，检测波长为280 nm。洗脱曲线见图5。 洗脱条件②：柱D2cm×50cm，进样浓度5%，进样量10g，进样速度1 d/s，洗脱速度1.5 d/2 s，进样pH值8.0，洗脱液为0.2 mol/L HCl，检测波长为280 nm。洗脱曲线见图6。 图5中吸光值从46-96管收集液有2个峰出现，图6中吸光值从18-42管收集液只有1个峰，表明洗脱条件②得到的CPPs纯度较好，而洗脱条件①得到的CPPs含有杂质。条件②用浓度0. 2 mol/L HCl做洗脱液比条件①用浓度0. 2mol/L HCI和0. 3 mol/L NaOH做洗脱液效果要好。 2.4酪蛋白磷酸肽的性质分析 2.4.1酪蛋白磷酸肽的溶解性质分析。比较了自制和购买的酪蛋白制备的CPPs的溶解度。按1.3.4.1中溶解度的测定方法，做3次平行实验，测得自制和购买酩蛋白制备酪蛋白磷酸肽的溶解度分别为76.2%和96.6%。购买酪蛋白比自制酪蛋白制备的CPPs的溶解度平均值高出20.4%a，说明自制酪蛋白制备的CPPs中含杂质较多。 2.4.2酪蛋白磷酸肽的检测。图7表明，酪蛋白在水解前其在280 nm附近有吸收，此吸收峰较小，而经酪蛋白水解得到的CPPs在280 run的吸收峰明显一些，这说明经水解酪蛋白生成很多短肽，而且这些短肽结构中含有较多的氨基酸，如Ser, Glu。