汪以真
我国畜牧业高效发展的一个重要特征是规模化、集约化，但随之面临的最大问题是畜禽的应激和疾病，通常普遍采取的对策是添加抗生素或其它药物。因此，在饲料中添加抗生素等药物添加剂以达到防病保健和促生长作用已成为动物营养与饲料界的普遍举措。但长期、高剂量使用、甚至是滥用抗生素和其它药物将导致动物肠道菌群平衡的破坏。动物体内药物残留和耐药性菌株的产生，给动物健康带来极其不利的影响，更为严重的是给消费者健康带来严重威胁。由此引起了人们对食品安全问题的极大关注。
继欧洲率先禁止近百种抗生素及有关药物在畜禽饲料中应用后美国及其它西方国家也正在淘汰饲料用抗生素。在我国，禁止和逐步淘汰绝大部分饲用抗生素也将成为必然，否则将严重影响我国畜产品在国际市场上的竞争力（以猪为例，我国肉猪的存栏量在5亿头左右，占世界总量46.1%;猪肉的产量占世界猪肉总量的46.2%，但出口量不到2%）。一旦限制或全面禁止饲用抗生素和有关药物的使用，对我国的畜牧业的发展将是一个巨大的打击。由此，研制安全、高效、环保型防病保健及促生长添加剂已成为近年来的研究焦点。因此，开展营养与免疫的基础或应用基础的研究，以期通过营养性添加剂或微量养分提高畜禽的自身免疫，特别是非特异性免疫研究乃是当务之急。
经典的免疫理论认为，像其它的哺乳动物一样，猪具有完善的免疫系统，在淋巴细胞、单核细胞和其它有关细胞的相互作用下执行免疫功能，体内还存在着专一性的免疫球蛋白和补体等，共同来清除自身异物和外来细菌和病毒。而猪肠道抵抗微生物能力主要依靠消化液（胃酸、胆汁酸等）、肠道粘膜溶菌酶等的杀菌作用和肠道上皮细胞的屏障作用。但从猪整个肠道细菌分布（小肠上段几乎无菌或存在极少量细菌，而到大肠段，细菌量可达1011个/g肠内容物）来看，在猪的免疫系统中可能还存在着新的抗菌因子以调节小肠中的细菌数量。1989年，随着Lee等从猪的小肠中分离出具有广谱抗菌效果的抗菌肽cecropinP1[1]，进一步证实了上述观点，并揭示猪肠道有可能主要依赖具有高效抗菌活性的抗菌肽来保护整个肠道粘膜和调节微生物区系平衡。由此人们提出动物肠道非经典免疫理论，并对非经典免疫成分（非特异性免疫因子）——抗菌肽产生了浓厚兴趣。 1 非特异性免疫因子抗菌肽的研究进展
最早关于抗菌肽的研究是由瑞典斯德哥尔摩大学Boman等人于1974年开始的， Boman等从美国惜古比天蚕蛹中首次获得抗菌肽[2]。自那时起，Steiner，Okada和Dickinson等许多研究者相继从不同的昆虫体中分离到了抗菌肽[3-5]，研究发现天蚕所具有的天然免疫力与其体内分泌的多种抗菌肽有关。进一步研究表明，除昆虫外，在哺乳动物嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板、骨髓、脾脏和上皮细胞等中都可以表达分泌多类抗菌肽，它们是动物抵抗外来细菌病毒入侵的第一道屏障，它们能识别和杀灭这些入侵并植被在动物机体内的有害微生物，在动物非特异免疫机制上发挥重要作用[6-8]，对确保动物特别是幼龄动物健康具有重要意义。在诸多种类的抗菌肽中，Cathelicidin是一个最大的抗菌肽家族，有关研究主要集中在欧美等国家。对Cathelicidin类抗菌肽的研究主要在以下几个方面：①抗菌效果及其它生物学功能研究[9-11]。Cathelicidin可分成α-螺旋、伸展螺旋（extended helical）、环状螺旋和β-折叠等类型，尽管在抗菌效果上各有侧重，但它们都有着广谱、高效的抗菌效果，对革兰氏阴性菌和阳性菌，如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等具有很强的杀菌作用，另外对真菌如白色念珠菌、隐球菌和包膜病毒和寄生虫都有较好的杀灭作用。此外，研究表明，Cathelicidin还具有促进伤口愈合、组织损伤修复、化学趋化、促血管生成和抗寄生虫等功能，在调节动物机体免疫上有着重要生物学活性；②抗菌机理研究[12-14]。目前比较公认的抗菌、抗病毒模式是“膜机制”。Cathelicidin家族中绝大多数是阳离子肽，能和细菌或病毒表面带负电荷的脂多糖结合，进入细菌或病毒细胞内，破坏细菌和病毒的胞膜结构，使内容物外泄，从而发挥高效抗菌、抗病毒效果，且细菌和病毒不易产生抗药性。最近研究发现了抗菌肽的一些新的作用机制，如细胞内作用模式。一些抗菌肽能刺激细菌和病毒胞内产生一种自我裂解酶，导致其自身灭亡。另外一些抗菌肽如PR-39可通过破坏细菌或病毒DNA复制和干扰蛋白质合成来达到抑制、杀死细菌或病毒的效果。此外抗菌肽与大分子协同作用模式，如抗菌肽Apidaecin和LeuA等需要与细菌或病毒内一些受体或停泊分子结合才能发挥抗菌和抗病毒的效果。还有些抗菌肽作为大肠杆菌脱甲酰基酶抑制剂而起着杀菌效果；③基因结构、生物合成和产生位点研究[15，16]。近年来研究集中于抗菌肽的基因结构，主要是其调控序列和潜在的调控膜块的结构研究。Cathelicidin基因包括四个外显子和三个内含子。前三个外显子编码前导肽区（preproregion）,第四个外显子编码剪切区域（cleavage region）和不同抗菌肽的功能区域。前导区由123～144个氨基酸残基，其中包括29～30氨基酸残基的信号肽。不同动物种类的Cathelicidin基因的前三个外显子编码的前导肽序列具有高度同源性。目前已确认有几个潜在的调控模块就存在于这些基因的5'端的调控区域，在这个区域存在着与动物免疫密切相关的NF（nuclear factors）因子的结合位点，如NF-白介素-6、NF-kB、白介素-6反应因子、APRE（急性炎性反应因子）、γ-干扰素反应因子和细菌LPS（脂多糖）以及一些与LPS诱导有关的蛋白结合位点。由第四个外显子编码的C-端（3'-UTR）的成熟肽序列包括12～97个氨基酸残基。在不同动物上有编码不同的成熟肽，在猪上，目前主要有PR-39、PG1-5、PF1-2和PMAPs等9种抗菌肽。
研究表明，Cathelicidins先是由其基因编码一个带有N-端信号肽的前导肽和肽原，储存在特定的细胞中（如白细胞、血小板、骨髓、脾脏和淋巴细胞）或在细胞内进行转运，然后这些肽原在适当的时候由一些蛋白酶裂解为成熟肽[17-19]。有些抗菌肽是适时按常规进行合成与分泌的，但有些抗菌肽是在一些诱导因子与调控区结合位点结合后而诱导表达的，如PR-39，当细菌、病毒入侵或一些免疫因子刺激的情况下被加强表达。研究还显示，猪PR-39的表达有着组织特异性，并与仔猪的日龄密切相关[20，21]。本课题组研究表明，断奶应激明显降低仔猪抗菌肽PR-39基因表达，锌能促进仔猪PR-39mRNA表达[22，23]。
上述有关Cathelicidins的基因结构和生物合成的系列研究揭示一个重要的机制，那就是大多数Cathelicidins类抗菌肽的表达是可以调控的。这为通过一些活性物质或微量养分加强幼龄动物抗菌肽的表达提供了研究依据。
2 非特异性免疫因子抗菌肽基因表达规律研究
在综合分析国内外的研究基础上，本课题组分别取1、14、28、42和56日龄的健康仔猪各3头屠宰后取骨髓用于PR-39和Protegrin-1基因克隆，仔猪断奶日龄为35d，并采用半定量RT-PCR方法研究了不同日龄仔猪抗菌肽PR-39和Protegrin-1基因表达的差异。将PR-39和Protegrin-1基因PCR产物电泳条带IOD值相对于β-actin电泳条带的IOD值进行半定量分析，并以平均值作图，见图1。

图1结果表明，抗菌肽PR-39在仔猪不同日龄时的表达有差异，在1～28日龄之间，其表达呈现增加的趋势，28～42日龄表达开始降低，42日龄比28日龄时的表达降低了46％（P<0.05），在42～56日龄之间又有所增加；抗菌肽Protegrin-1在仔猪不同日龄时的表达也存在着同样的变化规律，在1～28日龄之间，Protegrin-1的表达始终在增加，28～42日龄其表达显著降低，42日龄时的表达比28日龄时的表达降低了39％（P<0.05），在42～56日龄之间又有所增加。研究初步揭示断奶（本实验断奶日龄是35日龄）有可能降低仔猪抗菌肽PR-39和Protegrin-1基因表达。
3 非特异性免疫因子抗菌肽基因表达调控研究
从上述的初步研究结果（图1）显示，在断奶后一周抗菌肽有明显降低趋势，为此本课题组分别取21日龄（已断奶）、28日龄（已断奶），28日龄（未断奶）、35日龄（已断奶），35日龄（未断奶）、42日龄（已断奶）健康仔猪各3头，共18头仔猪，取骨髓用于PR-39和Protegrin-1基因克隆，进一步探讨在不同断奶日龄、断奶后与断奶前仔猪抗菌肽基因表达的差异，以揭示断奶对仔猪重要的非特异性免疫因子抗菌肽基因在转录水平表达时的影响。另外根据抗菌肽基因结构上可能的调控位点，探讨了锌和乳源生物活性因子（rPLF）对仔猪抗菌肽基因表达调控的影响。
3.1 断奶日龄对抗菌肽基因表达的影响
3.1.1 仔猪的断奶日龄对抗菌肽PR-39 基因表达的影响 采用半定量RT-PCR方法研究了不同断奶日龄对仔猪抗菌肽PR-39和Protegrin-1 基因表达的影响，将PR-39、Protegrin-1基因PCR产物电泳条带IOD值相对于β-actin电泳条带的IOD值进行半定量分析，并以平均值作图，见图2、图3。

图2结果表明，在断奶后的一周，猪骨髓抗菌肽PR-39基因的表达会发生显著的降低。21日龄断奶时，PR-39基因在28日龄的表达比在21日龄的表达降低了38％（P<0.05）；28日龄断奶时，PR-39基因在35日龄的表达比在28日龄的表达降低了46％（P<0.05）；35日龄断奶时，PR-39基因在42日龄的表达比在35日龄的表达降低了50％（P<0.05）。
3.1.2 断奶日龄对抗菌肽Protegrin-1 基因表达的影响 图3结果表明，在断奶后的一周，猪骨髓抗菌肽Protegrin-1基因的表达也发生了显著的降低。21日龄断奶时，Protegrin-1基因在28日龄的表达比在21日龄的表达降低了34％（P<0.05）；28日龄断奶时，Protegrin-1基因在35日龄的表达比在28日龄的表达降低了51％（P<0.05）；35日龄断奶时，Protegrin-1基因在42日龄的表达比在35日龄的表达降低了49％（P<0.05）。
3.2 微量元素Zn对PR-39基因表达的影响
选取96头35日龄断奶的仔猪，分成对照组（不添加任何锌源）、ZnSO4组（100mg Zn/kg）、ZnO组（100mg Zn/kg）、高ZnO组（3 000mg Zn/kg），每组3个重复，每个重复8头，饲喂各自日粮，饲喂15d后各组取3头仔猪屠宰，取骨髓用于PR-39基因克隆，并采用半定量RT-PCR方法研究了不同来源和不同水平的锌对仔猪抗菌肽PR-39基因表达的影响。将PR-39基因PCR产物电泳条带IOD值相对于β-actin电泳条带的IOD值进行半定量分析，并以平均值作图，见图4。

图4结果显示：不同锌源的添加均能提高PR-39 mRNA的表达量，与对照组相比，高ZnO组提高了PR-39 mRNA表达量378.26%，效果极显著。ZnSO4组和ZnO组分别使PR-39 mRNA表达量提高了38.4％和23.91%。
3.3 乳源生物活性因子（rPLF）对PR-39、protegrin-1基因表达的影响
按照品种、胎次相同，体重相近的原则，选择90头28日龄断奶，平均体重为7.2kg左右的仔猪，分成3个处理组，每个处理组3个重复，每个重复10头（公母各半），3个处理分别为对照组（不添加rPLF和抗生素）、抗生素组（添加20mg/kg黄霉素和110mg/kg金霉素，不添加rPLF）和rPLF组（添加rPLF，不添加抗生素）。试验期为30d，分断奶后1～15d和断奶后16～30d两个阶段。试验结束后，分别在断奶后第15d和第30d进行屠宰，每组取3头试验猪，取骨髓用于PR-39和Protegrin-1基因克隆，并采用半定量RT-PCR方法研究rPLF对仔猪抗菌肽PR-39和Protegrin-1基因表达的影响。将PR-39和Protegrin-1基因PCR产物电泳条带IOD值相对于β-actin电泳条带的IOD值进行半定量分析，并以平均值作图，见图5、图6。

图6 rPLF对断奶仔猪抗菌肽Protegrin-1基因转录水平表达的影响
从图5、图6结果可以看出，与不添加rPLF的对照组比，在28日龄断奶的杜长大仔猪断奶后1～15d饲喂rPLF均显著提高仔猪骨髓抗菌肽PR-39和Protegrin-1的基因表达，分别提高了143%（P<0.05）和217%（P<0.05）。对断奶16～30d仔猪的抗菌肽PR-39和Protegrin-1的基因表达也有增强的趋势，但没有产生显著水平(P>0.05)。与抗生素组相比，两组未见显著性差异。
4 小结与提示
4.1 在生物学发育规律上
抗菌肽的基因表达是随日龄呈现一定的生物学发育规律的，揭示了仔猪免疫力与非特异性免疫因子——抗菌肽的基因表达有密切关系。
4.2 在抗菌肽的基因表达调控上
①发现断奶应激显著降低仔猪肠道抗菌肽的基因表达；②高剂量ZnO（3 000mg Zn/kg）显著增强抗菌肽PR-39的基因表达，从而揭示了高剂量ZnO抗腹泻的新机理；③乳源生物活性因子是抗菌肽基因的有效的正调控剂，揭示了哺乳和在日粮中添加乳源生物活性因子对提高仔猪免疫力上具有极其重要的作用。
参考文献
1 Lee J Y, Boman A, et al. Proc. Natl .Acad. Sci. U.S.A., 1989,(86):9 159～9 162
2 Boman H G, et al. Infection and Immunity. 1974,(10): 136～145
3 Steiner H, Hultmark D, et al. Nature,1981,(292): 246～248
4 Okada M, Natori S. Biochem.J., 1983, (211):727～734
5 Dickinson L, Verginia R., et al. J. Biol. Chem., 1988,(263): 19 424～19 429
6 Boman H G. Gene-encoded peptide antibiotics and the concept of innate immunity: an update review. Scand. J. Immunol., 1998, (48): 15～25
7 Lehrer R I and Ganz T. Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defense. Curr. Opin. Immunol., 1999, (11): 23～27
8 Lehrer R I and Ganz T. Defensins of vertebrate animals. Curr. Opin. Immunol., 2002, (14): 96～102
9 Gennaro R and Zanetti, M..Structural features and biological activities of the cathelicidin- derived antimicrobial peptides, Biopolymers, 2000, (55):31～49
10 Travis S M, Anderson N N and Forsyth, W R, et al. Bactericidal activity of mammalian cathelicidin-derived peptides. Infect. Immun., 2000, (68): 2 748～2 755
11 Caroline A G, Lee W M and Prasad K, et al. Antimicrobial activity of magainin analogues against anaerobic oral Pathogens. International Journal of Antimicrobial Agents, 2003, (21): 75～78
12 Cudic M and Otvos L. Intracellular targets of antibacterial peptides. Current Drug Targets,2002,(3):101～106
13 Lehrer R I and Ganz T. Cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides. Current Opinion in Hematology, 2002, 9 (1): 18～22
14 Risso A, Braidot E and Sordano M, et al.BMAP-28, an antibiotic peptide of innate immunity, induces cell death through opening of the mitochondrial permeability transition pore. Molecular and Cellular Biology . 2002,22 (6): 1 926～1 935
15 Balaji Ramanathan 1, Elizabeth G. Davis 1 and Christopher R R,et al . Cathelicidins: microbicidal activity, mechanisms of action, and roles in innate immunity. Microbes and Infection, 2002,(4): 361～372
16 Hua Wu, Christopher R. Ross, Frank Blecha. Characterization of an upstream open reading frame in the 5- untranslated region of PR-39, a cathelicidin antimicrobial peptide. Molecular Immunology, 2002,(39): 9～18
17 Panyutich A, Shi J and Boutz P L, et al. Porcine polymorphonuclear leukocytes generate extracellular microbicidal activity by elastase-mediated activation of secreted proprotegrins,Infect. Immun. 1997, (65):978～985
18 Shi J and Ganz T. The role of protegrins and other elastase-activated polypeptides in the bactericidal properties of porcine inflammatory fluids, Infect. Immun., 1998,(66):3 611～3 617
19 汪以真,俞颂东,林文学. 猪肠道抗菌肽PR-39的基因克隆与序列分析.浙江大学学报,2002,28(6):685～688
20 Wu H., Zhang G and Ross, C R, et al. Cathelicidin gene expression in porcine tissues: roles in ontogeny and tissue specificity. Infect. Immun., 1999,(67): 439～442
21 Wu, H., Zhang G and Minton J E, et al. Regulation of cathelicidin gene expression: induction by lipopolysaccharide, interleukin-6, retinoic acid, and Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect. Immun., 2000, (68):5 552～5 558
22 汪以真,林文学,许梓荣. 半定量RT-PCR法评定不同生长阶段猪抗菌肽RR-39基因表达差异.农业生物技术学报，2004，12（1）：52～55
23 Wang Y. Z., Xu Z. R., Lin W. X., Huang H. Q., Wang Z. Q. Developmental gene expression of antimicrobial peptide PR-39 and effect of zinc oxide on gene regulation of PR-39 in piglets. Asian-Aust. J. Anim. Sci(SCI)., 2004, 17（12）：1 635～1 640
汪以真，浙江大学饲料科学研究所，教授，博士生导师，310029，浙江杭州。
收稿日期：2005-06-30