相振田 郭荣富 冯 宇
抗菌肽是生物体抵御外源性病原微生物入侵而产生的一类小分子多肽，是动物宿主先天性非特异防御体系的一个重要组成部分。抗菌肽是阳离子型活性肽，具有分子量小、热稳定性好、水溶性好，无免疫原性，抗菌谱广且抗菌机理独特等优点，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病等功能，且无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性。利用抗菌肽替代传统抗生素，对提高畜产品品质、推动绿色畜牧业的发展有着非常重要的意义。可通过生物工程的技术方法大量生产抗菌肽，使之成为新一代肽类抗菌药的来源。
1 抗菌肽来源及其分类
目前研究比较多的抗菌肽及其主要来源见表1。
迄今为止，从不同生物体内诱导的抗菌肽已有200余种，仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。根据来源可分为昆虫抗菌肽、水产动物抗菌肽、两栖类抗菌肽、哺乳动物防御素、植物防御素、微生物抗菌肽等。其中昆虫抗菌肽又包括杀菌肽类、昆虫防御素、富含脯氨酸的抗菌肽；哺乳动物防御素及植物防御素都分α、β亚型 (陈留存等，1999；陈颖等，2001)。根据抗菌肽的结构，可将其分为5类：①单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽或由无规则卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽，包括天蚕素Cecropins、Magainins等； ②富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽，如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)残基的抗菌肽；③含一个二硫键的抗菌肽，该二硫键的位置通常在肽链C端； ④有两个或两个以上二硫键，具有折叠结构的抗菌肽，实验证明，分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要[1]；⑤由其它已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。
2 理化性质
自1981年瑞典科学家Steiner等[2]首次从惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)中成功地分离出两种抗菌肽A和B，迄今已发现上百种。抗菌肽是由12～50个氨基酸残基组成的多肽，分子质量为4 000左右(李孝东等，2003)。这些抗菌肽有以下共同特点：①N端多富含碱性氨基酸，呈强碱性；②C端均酰胺化且C端中性疏水性；③绝大多数肽在第2位均为Trp，它对杀菌活性至关重要；④多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征，大多具有两亲α-螺旋和(或)两亲β-折叠结构；⑤抗菌肽对热稳定，许多抗菌肽在100 ℃加热10min还能保持一定活力。另外，部分抗菌肽尚有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的活力。
3 抗菌肽的作用机理
对抗菌肽的作用机制一直在研究中，目前认为有5种作用机理：①对胞膜攻击的作用。大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，最终导致肿瘤细胞和细菌死亡[3]。抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。②抑制细胞呼吸学说。Fehlbaum等(1996)从刺肩蝽（Podisusma－ eulieentris）成虫体内分离得到一种(属防御素家族)抗菌肽，因其对细菌和真菌都有很强的杀菌活性，所以被称为死亡素。用40μmol/l死亡素处理细胞1h后，细胞呼吸减弱，6h后，呼吸完全停止，因而认为死亡素可能是通过控制细胞的呼吸作用来杀菌的。③对线粒体的攻击作用。线粒体是细胞能量代谢最重要的细胞器。Bobek等[4]以人唾液中提取的抗菌肽MUC720作用于临床常见的真菌、杆菌和球菌，发现MUC720对真菌和细菌都有很强的杀伤作用，观察其超微结构发现线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和排列不规则，核膜界限不清，有的核破裂，内容物溢出，提示抗菌肽MUC720的作用机制可能与攻击线粒体有关。④抑制细胞壁的形成。sareo toxinslI能够抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻，但对已经形成的细胞壁无作用(Ando和Nation，1988)。⑤形成细胞膜电势依赖性通道(voltage-dependent channel), 首先抗菌肽分子中α-螺旋上的正电荷与细胞膜中磷脂分子的负电荷通过静电作用相互靠近，然后抗菌肽分子或是完全插入质膜中形成离子性质的通道[5]，或是结合在膜的表面像表面活性剂一样破坏脂双层有序结构[6]，进而达到杀菌的目的。尽管以上5种假说存在一定的区别，但大都强调抗菌肽作用机制的关键在于通过物理方式和质膜发生作用。
4 抗菌肽在畜牧业中的应用
4．1 在畜牧生产中的应用
抗菌肽能够取代或部分取代目前喂养动物所用的抗生素，减少动物养殖中对药物的依赖。目前在畜牧业实际生产应用的报告中只有少数试验报道。刘温发等(2001)报道，通过50L发酵罐培养中间试验，在优化发酵条件后，用甲醇诱导启动醇氧化酶启动子而成功表达抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌体外，培养液中抗菌肽的杀菌活力达5 000U/ml。进一步改进培养基配方，掌握较适宜的培养条件，包括pH值、温度、供气量及搅拌速度等，发酵生产周期可缩短到24h，杀菌活力达5 600U/ml。以这些工程酵母发酵液作试验，通过饮水摄入剂量为60U/（只·d）的粤黄鸡饲养试验，结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量，对粤黄鸡具有促生长、保健和治疗疾病的功能。
4．2 转基因动物的应用
鸡白痢、猪水肿病、猪肠炎、仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病一直是阻碍畜牧业发展的棘手难题。借鉴已成功的抗菌肽转基因工程，如转基因蚊子、转基因马铃薯、转基因水稻等，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种，不失为一条发展畜牧生产的新思路，前景广阔。运用基因工程方法，把牛TAP基因导入小鼠乳腺，在小鼠乳中检测到了牛TAP的存在，说明乳腺能转录出相应的TAP抗菌肽类，且TAP重组体数量多，比基因工程法合成抗菌肽费用低(Yams等，1996)。如果用相同方法，把抗菌肽基因转入猪体内，从而产出抗大肠杆菌感染的转基因仔猪，其经济效益和现实意义不言而喻[7]。
4．3 作为饲料添加剂应用
Hofmann等(1994)认为，各种动物在长期的自然进化过程中，体内已建立了平衡的微生物菌群共生生态系统，并建立了一套维持其体内菌群稳态的机制。抗菌肽是这一机制中的主要因子之一，广泛存在于所有脊椎动物和无脊椎动物机体中。高等动物肠道微生物菌群发达，不同动物的肠道内源性抗菌肽能抑制其相应的外源性病原菌，而对动物肠道共生生态系统中的微生物和动物细胞无杀伤作用，即高等动物肠道抗菌肽具有“种”特异性。应用各种动物的专一性、内源性抗菌肽作饲料添加剂，可使饲养动物受到外源病原菌入侵或应激时能特异性地维持其生长。据报道将含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料中，可减轻断奶仔猪的腹泻。目前广东省应用抗菌肽基因转化酵母进行高效表达，经发酵条件优化，生产抗菌肽酵母制剂，用作畜禽及水产饲料添加剂，代替抗生素预防和治疗仔猪白痢及雏鸡白痢有明显效果[8]。总之，抗菌肽作为饲料添加剂在畜牧生产中的应用有其独特的优势。抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，规模化发酵生产抗茵肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活[9]，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。抗菌肽杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性。以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，因其生产周期短、生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响，可大规模生产。再者，抗菌肽产品具广谱抗菌作用，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型饲料添加剂。
5 结语
随着细胞生物学和基因工程技术的发展，对抗菌肽的研究也越来越深入，一方面，在分子水平上研究抗菌肽在动物免疫防御系统中精细的合成过程及其调控机制；另一方面，探讨抗菌肽的药用开发价值，努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后的又一类重要的新型抗菌药物[10]。近年来，由于抗生素和传统兽药及饲料添加剂广泛使用所导致的抗药性和药物残留问题已经日益严重地威胁着人类及其后代的，寻找新型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽作为一类抗菌谱广且抗菌能力强、相对分子量较小、热稳定性好、水溶性好、可供选择范围广、靶菌株不易产生抗性突变的功能多肽，在医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程方面将有着广阔的应用前景。但是，目前关于抗菌肽的研究大多数处于实验室阶段，适用于局部治疗，其真正用于临床所必须解决的还有毒性、稳定性、免疫原性、应用方法、药物制剂等问题。我们相信，随着对抗菌肽结构与作用机理的不断深入研究，新型、高效、低毒、广谱的抗菌肽在农业、医药、食品等领域将会发挥重要的作用，为人类创造更大的价值。
参考文献
1 陈留存，王金星．昆虫抗菌肽研究现状[J]．生物工程进展，1999，19(5)：55~60
2 Steiner H D，Hultmark A, Engstrom H, et al. Sequence and specficity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Nature, 1981(292)：246～248
3 Dekker N，Cox RC，Kramer RA，et al． Substrate specificity of the Integral membrane protease OmpT determined by spatially addressed peptide libraries[J]．Biochemistry，2001，40(6)：1 694～1 701
4 Bobek LA，Situ H． MUC7 20-Mer:Investigation of Antimicrobial Activity，secondary Structure，and Possible Mechanism of Antifungal Action [J]．Antimicrob Agents Chemother，2003，47(2)：643～652
5 Wieprecht T，Apostolov O，Beyermann M, et al． Membrane binding and pore formation of the antibacterial peptide PGLa：thermodynamic and mechanistic aspects[J]．Biochemistry，2000，39(2)：442～452
6 Gazit E， Lee wJ，Brey PT, et al． Mode of action of the antibacterial cecropin B2：a spectroiluorometric study[J]．Biochemistry，1994，3(35)
7 汪以真，韩新燕，许梓荣．哺乳动物抗茵肽及其在畜牧生产上的应用前景[J]． 中国畜牧杂志，2002，38(4)：52～54
8 Pierce J C，Maloy W L，et al. Recombinant expression of the antimicrobial peptide polyphemusin and its activity against the protozoan oyster pathogen Perkinsus marinus[J].Mol Mar Bio technical，1997,(6)：248~259
9 Lee J Y，Boman A，Sun C，et al．Antibacterial peptides from pig intestine：Isola tion of a manmalian cecropin[J]．Proc Nail Acad Sci USA,1989，86
10 文加才，秦永忠，宋爱刚．阳离子抗菌肽的研究进展[J]．国外医药——抗生素分册，2002，23(6)：269～270
（编辑：张学智，mengzai007@163.com）
相振田，云南省动物营养与饲料科学重点实验室，650201，云南农大。
郭荣富，单位及通讯地址同第一作者。
冯宇，山东诸城信得药业。
收稿日期：2006-03-06 健康健康
抗菌肽是生物体抵御外源性病原微生物入侵而产生的一类小分子多肽，是动物宿主先天性非特异防御体系的一个重要组成部分。抗菌肽是阳离子型活性肽，具有分子量小、热稳定性好、水溶性好，无免疫原性，抗菌谱广且抗菌机理独特等优点，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病等功能，且无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性。利用抗菌肽替代传统抗生素，对提高畜产品品质、推动绿色畜牧业的发展有着非常重要的意义。可通过生物工程的技术方法大量生产抗菌肽，使之成为新一代肽类抗菌药的来源。
1 抗菌肽来源及其分类
目前研究比较多的抗菌肽及其主要来源见表1。
迄今为止，从不同生物体内诱导的抗菌肽已有200余种，仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。根据来源可分为昆虫抗菌肽、水产动物抗菌肽、两栖类抗菌肽、哺乳动物防御素、植物防御素、微生物抗菌肽等。其中昆虫抗菌肽又包括杀菌肽类、昆虫防御素、富含脯氨酸的抗菌肽；哺乳动物防御素及植物防御素都分α、β亚型 (陈留存等，1999；陈颖等，2001)。根据抗菌肽的结构，可将其分为5类：①单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽或由无规则卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽，包括天蚕素Cecropins、Magainins等； ②富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽，如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)残基的抗菌肽；③含一个二硫键的抗菌肽，该二硫键的位置通常在肽链C端； ④有两个或两个以上二硫键，具有折叠结构的抗菌肽，实验证明，分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要[1]；⑤由其它已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。
2 理化性质
自1981年瑞典科学家Steiner等[2]首次从惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)中成功地分离出两种抗菌肽A和B，迄今已发现上百种。抗菌肽是由12～50个氨基酸残基组成的多肽，分子质量为4 000左右(李孝东等，2003)。这些抗菌肽有以下共同特点：①N端多富含碱性氨基酸，呈强碱性；②C端均酰胺化且C端中性疏水性；③绝大多数肽在第2位均为Trp，它对杀菌活性至关重要；④多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征，大多具有两亲α-螺旋和(或)两亲β-折叠结构；⑤抗菌肽对热稳定，许多抗菌肽在100 ℃加热10min还能保持一定活力。另外，部分抗菌肽尚有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的活力。
3 抗菌肽的作用机理
对抗菌肽的作用机制一直在研究中，目前认为有5种作用机理：①对胞膜攻击的作用。大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，最终导致肿瘤细胞和细菌死亡[3]。抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。②抑制细胞呼吸学说。Fehlbaum等(1996)从刺肩蝽（Podisusma－ eulieentris）成虫体内分离得到一种(属防御素家族)抗菌肽，因其对细菌和真菌都有很强的杀菌活性，所以被称为死亡素。用40μmol/l死亡素处理细胞1h后，细胞呼吸减弱，6h后，呼吸完全停止，因而认为死亡素可能是通过控制细胞的呼吸作用来杀菌的。③对线粒体的攻击作用。线粒体是细胞能量代谢最重要的细胞器。Bobek等[4]以人唾液中提取的抗菌肽MUC720作用于临床常见的真菌、杆菌和球菌，发现MUC720对真菌和细菌都有很强的杀伤作用，观察其超微结构发现线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和排列不规则，核膜界限不清，有的核破裂，内容物溢出，提示抗菌肽MUC720的作用机制可能与攻击线粒体有关。④抑制细胞壁的形成。sareo toxinslI能够抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻，但对已经形成的细胞壁无作用(Ando和Nation，1988)。⑤形成细胞膜电势依赖性通道(voltage-dependent channel), 首先抗菌肽分子中α-螺旋上的正电荷与细胞膜中磷脂分子的负电荷通过静电作用相互靠近，然后抗菌肽分子或是完全插入质膜中形成离子性质的通道[5]，或是结合在膜的表面像表面活性剂一样破坏脂双层有序结构[6]，进而达到杀菌的目的。尽管以上5种假说存在一定的区别，但大都强调抗菌肽作用机制的关键在于通过物理方式和质膜发生作用。
4 抗菌肽在畜牧业中的应用
4．1 在畜牧生产中的应用
抗菌肽能够取代或部分取代目前喂养动物所用的抗生素，减少动物养殖中对药物的依赖。目前在畜牧业实际生产应用的报告中只有少数试验报道。刘温发等(2001)报道，通过50L发酵罐培养中间试验，在优化发酵条件后，用甲醇诱导启动醇氧化酶启动子而成功表达抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌体外，培养液中抗菌肽的杀菌活力达5 000U/ml。进一步改进培养基配方，掌握较适宜的培养条件，包括pH值、温度、供气量及搅拌速度等，发酵生产周期可缩短到24h，杀菌活力达5 600U/ml。以这些工程酵母发酵液作试验，通过饮水摄入剂量为60U/（只·d）的粤黄鸡饲养试验，结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量，对粤黄鸡具有促生长、保健和治疗疾病的功能。
4．2 转基因动物的应用
鸡白痢、猪水肿病、猪肠炎、仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病一直是阻碍畜牧业发展的棘手难题。借鉴已成功的抗菌肽转基因工程，如转基因蚊子、转基因马铃薯、转基因水稻等，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种，不失为一条发展畜牧生产的新思路，前景广阔。运用基因工程方法，把牛TAP基因导入小鼠乳腺，在小鼠乳中检测到了牛TAP的存在，说明乳腺能转录出相应的TAP抗菌肽类，且TAP重组体数量多，比基因工程法合成抗菌肽费用低(Yams等，1996)。如果用相同方法，把抗菌肽基因转入猪体内，从而产出抗大肠杆菌感染的转基因仔猪，其经济效益和现实意义不言而喻[7]。
4．3 作为饲料添加剂应用
Hofmann等(1994)认为，各种动物在长期的自然进化过程中，体内已建立了平衡的微生物菌群共生生态系统，并建立了一套维持其体内菌群稳态的机制。抗菌肽是这一机制中的主要因子之一，广泛存在于所有脊椎动物和无脊椎动物机体中。高等动物肠道微生物菌群发达，不同动物的肠道内源性抗菌肽能抑制其相应的外源性病原菌，而对动物肠道共生生态系统中的微生物和动物细胞无杀伤作用，即高等动物肠道抗菌肽具有“种”特异性。应用各种动物的专一性、内源性抗菌肽作饲料添加剂，可使饲养动物受到外源病原菌入侵或应激时能特异性地维持其生长。据报道将含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料中，可减轻断奶仔猪的腹泻。目前广东省应用抗菌肽基因转化酵母进行高效表达，经发酵条件优化，生产抗菌肽酵母制剂，用作畜禽及水产饲料添加剂，代替抗生素预防和治疗仔猪白痢及雏鸡白痢有明显效果[8]。总之，抗菌肽作为饲料添加剂在畜牧生产中的应用有其独特的优势。抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，规模化发酵生产抗茵肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活[9]，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。抗菌肽杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性。以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，因其生产周期短、生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响，可大规模生产。再者，抗菌肽产品具广谱抗菌作用，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型饲料添加剂。
5 结语
随着细胞生物学和基因工程技术的发展，对抗菌肽的研究也越来越深入，一方面，在分子水平上研究抗菌肽在动物免疫防御系统中精细的合成过程及其调控机制；另一方面，探讨抗菌肽的药用开发价值，努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后的又一类重要的新型抗菌药物[10]。近年来，由于抗生素和传统兽药及饲料添加剂广泛使用所导致的抗药性和药物残留问题已经日益严重地威胁着人类及其后代的，寻找新型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽作为一类抗菌谱广且抗菌能力强、相对分子量较小、热稳定性好、水溶性好、可供选择范围广、靶菌株不易产生抗性突变的功能多肽，在医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程方面将有着广阔的应用前景。但是，目前关于抗菌肽的研究大多数处于实验室阶段，适用于局部治疗，其真正用于临床所必须解决的还有毒性、稳定性、免疫原性、应用方法、药物制剂等问题。我们相信，随着对抗菌肽结构与作用机理的不断深入研究，新型、高效、低毒、广谱的抗菌肽在农业、医药、食品等领域将会发挥重要的作用，为人类创造更大的价值。
参考文献
1 陈留存，王金星．昆虫抗菌肽研究现状[J]．生物工程进展，1999，19(5)：55~60
2 Steiner H D，Hultmark A, Engstrom H, et al. Sequence and specficity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Nature, 1981(292)：246～248
3 Dekker N，Cox RC，Kramer RA，et al． Substrate specificity of the Integral membrane protease OmpT determined by spatially addressed peptide libraries[J]．Biochemistry，2001，40(6)：1 694～1 701
4 Bobek LA，Situ H． MUC7 20-Mer:Investigation of Antimicrobial Activity，secondary Structure，and Possible Mechanism of Antifungal Action [J]．Antimicrob Agents Chemother，2003，47(2)：643～652
5 Wieprecht T，Apostolov O，Beyermann M, et al． Membrane binding and pore formation of the antibacterial peptide PGLa：thermodynamic and mechanistic aspects[J]．Biochemistry，2000，39(2)：442～452
6 Gazit E， Lee wJ，Brey PT, et al． Mode of action of the antibacterial cecropin B2：a spectroiluorometric study[J]．Biochemistry，1994，3(35)
7 汪以真，韩新燕，许梓荣．哺乳动物抗茵肽及其在畜牧生产上的应用前景[J]． 中国畜牧杂志，2002，38(4)：52～54
8 Pierce J C，Maloy W L，et al. Recombinant expression of the antimicrobial peptide polyphemusin and its activity against the protozoan oyster pathogen Perkinsus marinus[J].Mol Mar Bio technical，1997,(6)：248~259
9 Lee J Y，Boman A，Sun C，et al．Antibacterial peptides from pig intestine：Isola tion of a manmalian cecropin[J]．Proc Nail Acad Sci USA,1989，86
10 文加才，秦永忠，宋爱刚．阳离子抗菌肽的研究进展[J]．国外医药——抗生素分册，2002，23(6)：269～270
（编辑：张学智，mengzai007@163.com）
相振田，云南省动物营养与饲料科学重点实验室，650201，云南农大。
郭荣富，单位及通讯地址同第一作者。
冯宇，山东诸城信得药业。
收稿日期：2006-03-06 健康健康