姚婷婷 赵培城 吕立获 顾东杰
摘 要 通过对5种蛋白酶的试验比较，确定了碱性蛋白酶作为乳蛋白的水解工具酶。并探讨了碱性蛋白酶的最佳水解条件：酶解温度50℃，pH值10.0，底物浓度10%，酶与底物浓度比5%，酶解时间为150min。水解液的苦味可通过活性炭的吸附除去。
关键词 碱性蛋白酶；乳蛋白；水解度
中图分类号 S879.1
牛乳含有丰富的蛋白质，约占牛乳干物质的3%～3.7%，主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白以及脂肪球膜蛋白。其中又以酪蛋白含量最多，约占总蛋白质的83%，它的必需氨基酸组成较为合理，是一种很好的动物蛋白质。近十年来的研究表明，牛乳中的某些多肽以及一些从牛乳蛋白水解而得到的多肽，具有某些生物活性，对于人体十分有益。研究表明，牛乳蛋白水解物（主要成分为乳蛋白肽）具有免疫调节、抗凝血、抗过敏、降血压和降低胆固醇等生理功能。本试验以脱脂乳粉为原料，碱性蛋白酶进行水解，研究了乳源活性肽的最佳酶解工艺。
1 材料与方法
1.1 原料与主要试剂
脱脂乳粉（杭州燕牌乳业）；胰蛋白酶、胃蛋白酶（上海化学试剂厂）；酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶（无锡博利生物制剂有限公司）；茚三酮显色剂；甘氨酸等。
1.2 主要仪器与设备
721分光光度计、数显恒温水浴锅、VAP30半自动定氮仪、LG10-2.4A高速离心机、精密酸度计、电子天平等。
1.3 分析检测方法
蛋白质含量测定采用凯氏定氮法；氨基态氮的测定采用茚三酮显色法和甲醛滴定法。
蛋白质水解度（DH%）=100×氨基态氮/总氮
1.4 工艺方法
脱脂乳粉→溶解→调pH值→酶解→灭酶→冷却→离心→干燥
1.4.1 酶解
称取一定量的乳粉，溶解配制成一定浓度的蛋白溶液，调节pH值，在恒定温度下，加入一定量的酶，进行酶解反应，酶解过程中要不断搅拌。
1.4.2 灭酶
达到反应预定的时间后，将蛋白水解液取出，于85℃水浴中灭酶10min后冷却。
1.4.3 离心分离
灭酶后的水解液以10 000r/min离心分离15 min，去除未水解的蛋白和其它不溶性杂质。
2 结果与分析
2.1 酶的筛选
在对乳蛋白的酶解反应中，选用了5种蛋白酶进行水解比较，从中筛选出水解效果最好的一种作为工具酶。经过反复试验，得出5种蛋白酶的最适酶解温度、pH值以及在此基础上，其它酶解条件相同[酶活添加量5 000U/g（料），底物浓度10%，水解时间3h]时水解度比较。结果见表1。健康
根据对5种蛋白酶水解乳蛋白的能力进行比较后，筛选出碱性蛋白酶对乳蛋白的水解能力最强，水解度可达到18.68%。因此，本研究选用碱性蛋白酶作为水解乳蛋白的工具酶。
2.2 单因素试验
为获得最佳的水解效果，本试验以底物浓度、酶与底物浓度比及时间为影响因素，首先进行了单因素试验，以此来确定碱性蛋白酶的最佳水解条件。
2.2.1 底物浓度对水解度的影响
碱性蛋白酶在水溶液中水解乳蛋白，底物浓度（S）即为乳蛋白质量与水的体积比。根据文献，乳蛋白浓度以10%为宜。本试验在底物浓度为6%、8%、10%、12%、14%的条件下进行水解，温度50℃，pH值为10.0，酶与底物浓度比3%，水解120min。以DH为指标，确定碱性蛋白酶水解乳蛋白的最佳底物浓度。试验结果见图1。
由图1可知，底物浓度在10%之前，水解度随着底物浓度的增大而增大；底物浓度在10%以后，水解度的变化趋势逐渐趋于平缓，与之前曲线的较陡形成对比。其原因是底物浓度过高，体系流动性差，不利于酶与底物的接触。因此，底物浓度为10%是最好的水解条件。
2.2.2 酶与底物浓度比对水解度的影响
分别在酶与底物浓度比为1%、2%、3%、4%、5%的条件下进行水解，温度50℃，pH值10.0，底物浓度10%，水解120min。以DH为指标，确定最佳的酶与底物浓度比，试验结果见图2。
试验中水解初期（30min之内），水解速率与酶浓度呈正相关，随着水解时间的延长水解速率逐渐下降，同时，DH趋向于一个水解度的极限值。不同初始酶浓度，DH极限值不同，其值随着初始酶浓度的提高而提高，但当酶浓度较高时其水解度与极限值较为接近。考虑经济效益，认为酶与底物浓度比为3%~4%较为适宜。
2.2.3 反应时间对水解度的影响
取温度50℃，pH值10.0，底物浓度10%，酶与底物浓度比3%，以DH为指标，确定最佳水解时间。水解度随时间的变化情况见图3。碱性蛋白酶水解乳蛋白反应平衡很快，在前30min时，水解度随着时间的变化趋势很陡，之后水解速度缓慢。在120~180min时间段内，水解度几乎达到极限，变化不大。
2.3 正交试验
根据单因素试验的结果，对碱性蛋白酶进行正交试验，表2为三因素三水平表。
碱性蛋白酶正交试验数据和极差分析见表3。由表 3 可以看出，在影响碱性蛋白酶酶解效果的 3个酶解因素中，其影响程度大小为 A >B > C；得出的最佳的酶解条件为 A2B3C2，即酶解温度50℃，pH值10.0，底物浓度10%，酶与底物浓度比5%，酶解时间为150min。
试验证明，在此条件下乳蛋白水解度达到23.56%，且苦味较轻。
2.4 脱苦试验
碱性蛋白酶酶解得到的水解液具有一定的苦味，加入8%（W/V）的活性炭，苦味可消除。
3 结论
碱性蛋白酶能有效地水解乳蛋白，水解的最佳条件为酶解温度50℃，pH值10.0，底物浓度10%，酶与底物浓度比5%，酶解时间为150min。水解液具有轻微的苦味，利用活性炭的吸附作用进行脱苦，用量为8%(Ｗ/Ｖ)时，效果理想。
参考文献
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（编辑：高 雁，snowyan78@tom.com）
姚婷婷，浙江工业大学，310032，浙江杭州。
赵培城、吕立获、顾东杰，单位a及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2005-09-19