鸡抗猪产毒素性大肠杆菌卵黄抗体的特性及应用

程福亮  梁瑾  康雪燕  谷巍

(山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安，271000）

摘要：产毒素性大肠杆菌是导致仔猪腹泻的重要病原体之一。鸡抗猪产毒素大肠杆菌卵黄抗体具有性能稳定、作用便捷等优点，充分发挥被动免疫作用，显著降低仔猪腹泻的发生率和严重程度，是当前防治仔猪大肠杆茵性腹泻的研究热点。本文简要介绍国内外鸡抗猪产肠毒素性大肠杆茵卵黄抗体的特性、作用机制及应用前景。

关键词：产肠毒素性大肠杆菌；仔猪；卵黄抗体；应用

Abstract: Toxigenic Escherichia coli in piglets diarrhea primality is one of important pathogens. Egg yolk antibody of toxigenic Escherichia coli has stable performance and convenient advantages， still full play the role of passive immunity. It can significantly reduce piglet diarrhea incidence and severity. It is closed to the research hotspot of prevention and treatment of piglet Escherichia coli now. This paper briefly introduced the domestic and foreign chicken antibodies to porcine enterotoxigenic Escherichia coli bacteria of yolk antibody characteristics， action mechanism and prospect in application.

仔猪大肠杆菌性腹泻主要是由产肠毒素性大肠杆菌(ETEC）引起的仔猪的一种常见病，严重影响养猪业的发展。目前对本病的防治除加强综合性预防措施以外，生产上多采用ETEC的多价疫苗和基因工程苗免疫母猪，提高初乳中的抗体水平，以防治哺乳仔猪的产肠毒素大肠杆菌性腹泻。然而母乳中的抗体保护作用是有限的、暂时的，在断奶后短期内将消失。鉴于被动免疫在防治仔猪腹泻中的重要作用，寻找替代母乳的外源性抗体成为关键。仔猪口服高免疫血清能够预防仔猪腹泻，然而因其生产成本较高、产量较低而在使用中受到限制；卵黄抗体生产成本较低，易于大量生产出高效价的抗体，因其独有的良好特性和在防治新生仔猪和断奶仔猪腹泻方面收到的明显效果，一直以来深受国内外研究人员的重视。多年来，研究人员一直致力和尝试着研究开发卵黄抗体，并力求进行规模化生产，为解决畜牧行业中仔猪腹泻这一难题带来一种新思路和新方法。

l  卵黄抗体及其特性

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初。l889年，Klemperer[1]首次发现了卵黄中富含抗体；1934年，Jukes[2]通过研究发现母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护；1969年，Leslie和Clem[3]将这种可转移到卵黄中的抗体命名为IgY。存在于禽卵黄中的免疫球蛋白主要是IgY，IgM、IgA和 IgD的含量极少。鸡IgY在功能上相当于哺乳动物的IgG。

1.1 性能稳定  卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工以及摄食、消化过程中，对保证抗体活性的稳定性是非常关键的。王炯等[4]的试验表明，鸡IgY具

有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热。李学伍等[5]将抗仔猪大肠杆菌卵黄抗体制成喷雾干燥粉，除了黏附在管壁上的抗体滴度稍有下降外，正常喷出的干粉抗体滴度与卵黄液一致。Jin等[6]的体外试验表明，经喷雾干燥的含抗K88菌毛抗体的鸡卵黄粉能有效阻碍K88-ETEC与猪小肠黏膜的黏附。卵黄抗体较易保存，Larsson等[7]认为在 4 ℃条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。鸡抗仔猪腹泻卵黄抗体对pH值的耐受性研究报道较少，Hatta等[8]通过检测了3种主要消化道酶对抗HRV Ig Y的影响，结果表明Ig Y对胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶有一定的抵抗作用。由于幼畜胃内酸度不大，IgY在胃内一般不会严重失活，在幼畜日粮中添加IgY可获得有效的被动免疫。但是对年龄较大的动物来说，有必要对IgY进行保护，以免在胃内被消化。

1.2 产量高  卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上[7，9]。1只高产蛋鸡(平均每周产蛋5-6枚，每只蛋中约含抗体100-150 mg[7]）所产蛋中的抗体量相当于90-100 mL血清或 180-200 mL血液。例如1只兔子1个月可提取IgG约200 mL，而1只蛋鸡1个月从蛋中可提取2000 mL以上。此外，在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便得多。

1.3 安全性高  王忠泽等[10]用治疗剂量(80-300 mg/kg）的10-40倍进行试验，没有发现毒性反应。美国食品和药品管理局 (FDA)认为，卵黄免疫球蛋白作为食品比作为药物更有利，并将其列入“一般公认安全物质”范畴。说明规范生产使用卵黄抗体是安全的。

2 鸡抗猪产肠毒素性大肠杆菌卵黄抗体的作用机制

2.1 IgY可直接粘附于病原菌的细胞壁上，改变病原菌细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长。在体外将不同质量浓度的IgY添加到不同浓度的大肠杆菌中，室温下培养0.5 h，然后将混合物加到琼脂培养平板上35 ℃下培养18 h，结果添加0.25 mg/mL抗体悬液组的大肠杆菌生长受到抑制[11]。采用分离提纯的特异性菌毛抗原制备抗ETEC的卵黄抗体，再用细菌体外粘附试验研究卵黄抗体预防仔猪ETEC感染性腹泻的机制，结果表明，在大肠杆菌培养液中添加含量0.5 mg/mL抗猪大肠杆菌卵黄抗体，大肠杆菌K88ac生长受到抑制。抗体效价为1：640和1：1 280的卵黄抗体均较对照组显著地抑制了K88ac。平均每个肠上皮细胞仅分别粘附8.5和2.4个细菌(P<0.01) 。不同抗体间没有交叉反应[12]。

2.2 IgY可粘附于细菌的菌毛上，使细菌不能再粘附于肠道黏膜细胞上。添加IgY可使细菌不能再粘附于肠道黏膜细胞上，从而阻断细菌在定植部位增值以及产生毒素。Yokoyama[13]等研究了含抗 K88、K99和987P肠毒性大肠杆菌菌毛的IgY对大肠杆菌粘附性的影响。将一种大肠杆菌和与其有特异性的IgY混合物培养，然后测定粘附于肠道细胞的大肠杆菌数。结果表明lgY与大肠杆菌具有很好的粘附作用，各个试验组肠细胞平均粘附细菌个数均要高于对照组，且各IgY之间无交叉反应[8]。此外，添加含量为0.25 mg/mL抗猪大肠杆菌卵黄抗体溶液，对大肠杆菌在肠黏膜细胞上的粘附也有一定的抑制作用[11]。

2.3 抗特异病原的 IgY在肠道内被消化酶降解，降解产物含有抗体末端高度可变的小肽。这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定病原菌的粘附因子结合，使病原菌不能粘附易感细胞而失去致病性，从而可对非肠道病原菌发挥抑菌作用。同时，这些小肽还能与宿主血液中球蛋白结合，使其免遭机体破坏。

3 卵黄抗体在仔猪中的应用

3.1 卵黄抗体防治仔猪大肠杆菌性腹泻的效果

用鸡卵黄抗体控制哺乳动物和人的病毒和细菌病以前有所报道[14，16]。但用卵黄抗体控制仔猪大肠杆菌性腹泻的研究还只在20世纪90年代由Yokoyama等首先进行。Yokoyama等[17]首次用卵黄抗体控制仔猪大肠杆菌病，他们将提纯的 ETEC宿主特异性菌毛K88、K99和987P制成菌毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫产蛋母鸡，抗体水平达到高效价后，收集鸡蛋，分离和喷雾干燥卵黄抗体，对感染不同ETEC菌株的初生未采食的哺乳仔猪进行卵黄抗体治疗。结果显示，所有仔猪接受不同菌株感染后l2 h内均发生腹泻；用效价为1：625和1：2500的抗体治疗，仔猪全部存活，而对照组仔猪死亡率超过80%。胡子信等[18]用 K88、K99、987P三价灭活苗试制了4批鸡抗猪ETEC卵黄抗体，在北京近郊5个县9个猪场近900头仔猪上进行防治试验，对于确诊为大肠杆菌引起的仔猪黄痢、白痢其有效率为100%。肖驰等[19]分别制备了抗K88、K99、987P和F41菌毛抗原和菌体抗原的卵黄抗体，分别给初生仔猪投服后，7日龄的仔猪腹泻率由47.7%下降至9.4%和l8.6%，8~l2日龄的仔猪腹泻率也比对照组下降了9.5%和 l2.1%。结果表明，两种卵黄抗体都有效，但菌毛抗原的卵黄抗体效果更好。试验还显示卵黄抗体对仔猪黄痢的治愈率高于庆大霉素、土霉素和痢特灵。李学伍等[5]将仔猪大肠杆菌卵黄抗体制成干粉，其抗体效价不变，试验表明胃液对干粉抗体影响不大，该卵黄抗体粉对发病仔猪的治愈率可高达97.7%，比药物治疗的治愈率高21.2%。Marquartl等[20]研究表明，用K88+ETEC诱导3日龄仔猪腹泻，再用鸡卵黄抗体治疗，24 h后被治愈，而用未免疫鸡的蛋黄粉处理后，仔猪继续腹泻，其中 62.5%因严重腹泻而死亡。Yokoyama等[14，21]在饲粮中添加抗F18菌毛卵黄抗体对感染 F18+ETEC的断乳仔猪获得了良好的保护作用，降低了腹泻的发生率和严重程度。

3.2 提高早期断奶仔猪的生产性能

卵黄抗体本身是蛋白质，含有卵黄的营养成分，有着促生长作用。王建明等[22]在21日龄断奶仔猪日粮中添加0.2%卵黄抗体，结果表明第一周的平均日增重、平均耗料量和饲料报酬分别提高76.8%、14.5%和35.1%，试验期14 d的平均日增重、平均耗料量和饲料报酬也均有提高的趋势。使用卵黄抗体添加剂的试验组比对照组分别提高23.7%、11.4%和10.0%，表明卵黄抗体添加剂可明显促进断奶仔猪的增重和饲料转化率。陈鲁勇等[23]选用脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体防治腹泻，卵黄抗体、胆囊收缩肽(CCK）卵黄抗体等组成的复合抗体作为21日龄断奶仔猪饲料的添加剂。结果表明，21~35日龄阶段，试验组比对照组平均日增重提高了7.14%(P<0.05)，差异显著说明复合卵黄抗体粉剂有促进断奶仔猪生长的作用，试验组的料重比比对照组下降6.0%。Marquardt等[17，24]的试验表明，21日龄断奶仔猪使用卵黄抗体添加剂可以有效地降低仔猪下痢的头数，减少死亡率，提高增重水平。其他研究者也同样证实卵黄抗体添加剂的促生长效果[25-26]。

4 卵黄抗体的应用前景

卵黄抗体成本低、使用方便、保存容易，可以经口服而在小肠内局部发挥作用，不存在药物残留和耐药性的问题；而且卵黄抗体液本身也是蛋白质，有促生长作用。如将鸡卵黄抗体经喷干后，用于饲料添加剂，既可用于疾病的防治，又能促进生长发育，而且还能克服药物治疗的某些缺点，具有很大的开发前景。但同时也存在着一系列的问题制约着其开发应用。

4.1卵黄抗体的生产工艺  当前对卵黄抗体的开发主要是制备卵黄抗体液和喷干获得卵黄抗体粉，但两者在生产工艺和使用途径中是有所不同的。卵黄抗体液多用于治疗，且效果要好于卵黄抗体粉。但在保存方面存在着弊端，一定程度上影响了其开发应用。而卵黄抗体液在添加保护剂后，喷干获得的卵黄抗体粉，具有较长的保质期，且对抗体效价影响不大，还可以消除因卵黄抗体可能带来的垂直传播疫病可能。这样在卵黄抗体粉应用方面，既可以作为治疗剂型用于治疗仔猪腹泻，又可以作为绿色、安全和无污染的添加剂预防仔猪的腹泻。但在生产工艺方面，存在着吸潮等诸多问题，还需要进行深入的研究。

4.2 卵黄抗体的病原体选择  不同地区引起仔猪腹泻的ETEC菌毛抗原不完全相同，只有用于这些菌毛抗原相应的抗体才能起到治疗作用。此外，临床中导致仔猪腹泻的原因除了日常管理因素外，导致该病的病原体较多，如轮状病毒、猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎以及寄生虫病等。如果要开发鸡抗仔猪腹泻的卵黄抗体需要对日常管理、疫苗制备、生物安全以及生产工艺等各个环节进行宏观考虑，综合把关,这样才能有效的解决卵黄抗体对临床上仔猪腹泻的防治效果和生产成本的问题。

4.3 卵黄抗体的生产标准  目前卵黄抗体在制备、提纯和使用过程中缺乏统一的标准和成熟的方法。在生产中没有统一的质量标准可执行，没有规范的操作规程，缺乏用于监测的质量标准和市场合理化管理及引导，因此卵黄抗体的应用是一个科学论证和规范的过程。

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