彭慧珍 罗振福 贺建华
湖南农业大学动物营养研究所
摘要：抗菌肽是动物体以及人类自身免疫系统中重要的组成部分。自从上个世纪70年代初由瑞典科学家Boman HG首次发现后，人们逐渐开始关注这一具有广谱抗菌性能，且相对于抗生素具有高效和无残留等显著优点的抗菌物质。随着对其研究深入，人们对抗菌肽的分布、结构和作用有了很大认识，并根据需要进行了分类。本文主要介绍抗菌肽的来源及其各自结构、分类的研究进展等，为今后的研究和学习提供借鉴。
关键词：抗菌肽；研究进展；畜牧业
Advance in the research of Antimicrobial protein and its application in animal husbandry
Peng Huilin Luo Zhenfu He jianhua
（College of Animal Science and Technology of Hunan Agricultural University， Chang Sha， Hu Nan， 410128）
Abstract： Antimicrobial peptide was an important ingredient of animal and human immune system． Since discovered by Boman HG of Sweden in 1970s， this antibiotic substance with broad－spectrum antibiosis which was no－residual and more efficient compared to antibiotic was becoming being concerned gradually． As the study went further， people had known much more disposition， structure and function of antimicrobial peptide than before， and then classified them by requirement． The advance of resource， classification，construction of antimicrobial peptide and its application in animal husbandry were mainly introduced in this paper， which could provide the later study with some experience．
Keyword： antimicrobial peptide；advance；animal husbandry
1 前言
抗菌肽（antimicrobial peptide）又称抗菌生物肽或肽抗菌素，在生物体内广泛存在，是生物体用来抵制外来入侵病原体，具有抗菌作用的一类小分子蛋白质。世界上第一个被发现的抗菌肽是20世70年代瑞典科学家Boman HG在用大肠杆菌诱导惜古比天蚕（Hyatophora cecropia）时分离得到的，命名为天蚕素（cecropin） [1]。此后到现在的30多年时间里，人们相继从微生物、两栖类动物、植物、哺乳动物和人类中发现并分离获得具有类似性质的活性多肽，至今已从自然界中发现超过900多种，且每年都以较高的速度增长[2]。
抗菌肽分子量小，具有等电点高、热稳定好和广谱抗菌等特点，不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有较强的杀灭作用，对某些真菌和耐药性细菌也具有杀灭作用。其在自然界中广泛存在，且在各种物种中的含量和结构不尽相同，加之抗菌肽具有优良的抗菌性能，学者们一直在探索利用生物和基因工程大量获得该物质，这都使得其成为当前各国研究的热点之一。
本文综述了近年来各国学者在自然界各种生物中发现的一些主要抗菌肽种类，结合以往研究成果，介绍了各种抗菌肽的基本结构和特点，主要论述其来源和分类研究进展，为今后开展抗菌肽生物和基因工程研究提供经验和借鉴。
2 抗菌肽分布及其结构
目前，在各种原核生物和真核生物中均有抗菌肽存在的报道，现将已发现的、并作为研究重点的一些主要抗菌肽及其结构按来源分述如下。
2．1 昆虫源抗菌肽
从发现第一个昆虫抗菌肽——天蚕素以来，人们已从昆虫体内分离提取出超过170种抗菌肽，其中研究得最为广泛的是天蚕素及昆虫防御素。天蚕素是3种蚕（Hyalophora cecropia， Antheraea pernyi and Bombyx mori）免疫应答反应的主要组成部分，分为天蚕素A、B、D3种，包含35～38个不等的氨基酸残基。通过序列分析和环二色性测定，所有天蚕素二级结构含有一个螺旋－卷曲－螺旋结构，这一点在天蚕素A上已经通过核磁共振分析得到证明，其－NH2末端螺旋含有一个有效静电荷（天蚕素A为6个），呈兼性，而－COOH末端螺旋电荷相对较弱，更具疏水性，其单环由在所有天蚕素中都是保守的Gly23和Pro24 2个氨基酸残基连接[3]。
昆虫防御素类（Defensin type）则是由29～40个氨基酸残基组成的多种阳离子肽，分子量4kD左右，具有特征性的反向平行β－折叠结构，富含Cys。在现实生活中，大部分昆虫防御素都是由试验感染动物的淋巴分离获得，然而对于蝎子、白蚁和软体动物门这三类，它却可以存在于非感染动物的颗粒型血细胞中。所有的昆虫防御素都有一个共同的6个半胱氨酸基序列，形成3个分子内二硫键，对革兰氏阳性菌有强的抗性，但是对革兰氏阴性菌的抗性则较弱。如从果蝇属中分离的抗菌多肽drosomycin、从麻蝇中分离出的holotricin、以及昆虫抗菌肽metchnikowin和thanatin等。
2．2 植物源抗菌肽
植物抗菌肽是植物自身合成的能够防御环境中微生物侵害的一类小分子多肽。目前已发现8个家族的植物抗菌肽，分别是是硫素（thionins）、植物防御素（plant defensins）、脂转移蛋白（lipid transfer proteins）、橡胶蛋白类（hevein－1ike peptides）、打结素类（knottin－like peptides）、凤仙花素（IbAMP）、蜕皮素（snakins）以及MBP1，其大小从2KD～9 kD不等。
在植物中发现的抗菌肽几乎都属于二硫键铰链多肽，富含半胱氨酸，并且所有的半胱氨酸都形成分子内二硫键，它们大都是阳离子多肽，有较好的热稳定性。其中研究比较广泛的是植物防御素，MENDEZE[4]等人于1990年首次从大麦、小麦种子中分离出植物该物质，并命名为γ－thionins，随后因发现与哺乳动物和昆虫的防御素结构有很大相似性，故重新命名为植物防御素。THOMMABP[5]经分析各类植物防御素发现分子量一般在5KD左右，一般含有45～54个氨基酸残基，且其中所含的Cys是高度保守的。典型的植物防御素包括一段3条链的反平行的β－折叠和一段α－螺旋，其中α－螺旋中的CXXXC片断的Cys通过分子内二硫键与C末端β链的CXC片断中的Cys相连，BONMATIN J M[6]证明其结构模型与昆虫防御素相同。
此外，Bruno P A[7]等人从紫茉莉中分离提取出2种植物抗菌肽，命名为MJ－AMP1和MJ－AMP2，分别由37和36个氨基酸残基构成，二者都含有3个二硫键，且仅存在4个氨基酸序列的差异。经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现它们可以由原始形态凝聚成为二聚物，表现出广谱抗菌性能。
2．3 微生物源抗菌肽
微生物抗菌肽是微生物分泌的用以保护自身，杀灭或抑制其它细菌、真菌等的小分子多肽，包括环形肽、糖肽和脂肽，如短杆菌肽、杆菌肽、多黏菌素肽和乳酸链球菌肽等[8]。无论由何种微生物合成或分泌，微生物源抗菌肽都有一些共同个特点，即：一般含有10～20个不等的氨基酸残基，分子量为3000Da左右（只有极少数超过9000Da）。其中由乳酸菌（1actic acid bacteria，LAB）产生的细菌素和由木霉属土壤真菌非核糖体肽合成酶（non－ribosomal peptide synthetase NRPS）合成的Peptaibol是目前研究得最多、最深入的微生物抗菌肽。Twomey D[9]指出由乳酸菌产生的乳酸菌球菌肽A、Z、3147含有33～36个氨基酸残基不等，分子量分别为为3353、3330、3323。Chugh JK等人将现有的Peptaibol分为9个亚类后，通过序列组成分析，发现所有的Peptaibol都含有40%的α－氨基异丁酸（AIB），C末端为氨基醇的肽，分子长度在5－20残基之间，多数为l5～20残基[10]。如今，随着人们对抗菌肽研究深入，有越来越多的微生物源抗菌肽被发现，如芽胞杆菌（Bacillus suhtilis Jm4）产生的Subpetin JM 4－A/B、鼠链球菌（Streptococcus rattus）产生的BHT－A/B、蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii ST4V）产生的Peptide St 4 V、短链球菌（Streptococcus boyis HjS/ Hc5）产生的Bovicin HJ 50/HC 5[11－15]。
2．4 两栖类源抗菌肽
1987年Zasloff发现了第一个两栖类抗菌肽，并命名为Magainins，它是爪蟾产生一类含有21～27个氨基酸残基的碱性元半胱氨酸的抗菌肽[16]，也是目前研究得较多的一类两栖抗菌肽。Maria Luisa Mangoni[17]等人以Rana esculenta为试验对象检验抗菌肽的分泌，结果表明，两栖动物皮肤腺可以分泌大量抗菌肽，但是其在无菌状态下是不分泌的，需经过微生物的刺激，且那些在普通环境下的蛙腺细胞具有可再生的能力，那些在无菌环境下处理过的蛙腺细胞则不具备此能力。MSI－78和MSI－594是Magainin的两种衍生类似物，前者氨基酸序列经测定为GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK－NH2，含有9个单位阳离子电荷，后者序列则为GIGKFLKKAKKGIGAVLKVLTTGL－NH2，含有6个单位阳离子电荷[18] ，二者都具有较好的抗菌性能。
从目前发现、分离的两栖类抗菌肽和以往的研究来看，其主要来源是蛙类和泥鳅等易于实验的动物，且几乎所有已发现的两栖类抗菌肽一级结构都得到了分析，氨基酸残基数集中在20－35个之间（少数抗菌肽残基数超过了40）。除Distinctin以外，两栖类抗菌肽均为单链肽，含有较多的亮氨酸和异亮氨酸残基，属于疏水肽，同时也含有一些精氨酸和赖氨酸残基，因而又属于阳离子肽。
2．5 哺乳动物（除人以外）源抗菌肽
哺乳动物的抗菌肽广泛存在于嗜中性白细胞、肠道黏膜和皮肤等位置。目前研究的重点主要集中在两类抗菌肽分子，一类是哺乳动物防御素，一类是Cathelicidin家族[19]。前者一般为3～4kD的阳离子小肽，由6个半胱氨酸组成链内二硫键和杀菌机制相关的双亲性分子结构，相比之下，后者则结构简单，不含半胱氨酸，为线性分子。
有学者根据肽链长度、氨基酸序列同源性、基因结构和表达位点，β－防御素可分为两种，第一种为含68～69个氨基酸残基的前体肽，且每个残基均含有一个内含子大于6．5Kb的相关基因。第二种则少5～6个残基，每个残基含有一个内含子小于2Kb且连接十分紧密的基因。但因很多抗菌肽基因家族存在明显的中间差异，此分类仍有待商榷。
此外，还有一些猪体抗菌肽也备受人们关注，如从猪小肠纯化的NK－lysin、PR－39和由猪白细胞提取的Protegrins（PGs），它们分别含有78、39、16～18个氨基酸残基，分子量从3339Da～8294Da不等，对各种病原菌都有明显的杀灭作用[20，21]。
2．6 水产类抗菌肽
从以往的研究看，水产中发现的抗菌肽主要集中在鱼、虾类，且发现的数量远不及其它物种。但是与其它来源抗菌肽相比，水产类抗菌肽具有溶血效应小，种类多样化等优点，表现出更强的杀菌作用和比其它种类更具优势的应用前景。目前，从南美白对虾中（Shrimp Penaeus vannamei）提取的Penaeidins是发现得较早且研究得最深入的水产类抗菌肽，其成熟分子大约由52－60个氨基酸残基组成，含有较多的阳离子，N端富含脯氨酸，C端由3个分子内二硫键维持稳定[22]。 Delphine Destoumieux[23]等人指出抗菌肽Penaeidins产生并储存于虾类的粒性白细胞中，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性，一旦遇微生物的刺激即可释放出来发挥作用。
水产类抗菌肽一般由20～60个氨基酸残基组成，分析各国学者已报道的序列，发现这些多肽氨基酸序列间的同源性较低，种间差异极大，但也存在一些共同特征，即：含有较多精氨酸或赖氨酸、分子带正电、含有较多疏水氨基酸、可使分子折叠成疏水或双亲性α螺旋结构等。
2．7 人类源抗菌肽
人类抗菌肽结构类似于其它哺乳动物抗菌肽，具有很大的同源性，但数量较之要少得多。目前其研究主要集中在2种，一种是Cathelicidin家族，另外一种是防御素。前者在人体内仅有一种——LL－37，由hCAP－18（Human cathelicidin antimicrobial peptide 18）经丝氨酸蛋白酶3水解产生 [24]，含有37个氨基酸残基，N－端前2个残基为亮氨酸。而人类防御素（hBD）则分为α（10种）、β（4种）两类，德国人Harder J于1997年首次发现hBD－2，其属于β－防御素类，分子由41个氨基酸残基构成，含有较多正电荷，肽链折叠形成3个β－片层结构，由6个半胱氨酸残基形成3个二硫键稳定结构[25]。hBD－1结构与hBD－2类似，但只由36个氨基酸残基组成，属于短肽[26]。
无论是Cathelicidin家族还是人类防御素，其分子量都集中在3～4KD之间，属于阳离子肽，能在体内形成一层保护屏障，是人类免疫系统的重要组成部分。
2．8 人工合成抗菌肽
除了以上从自然界发现的天然抗菌肽，人们还通过生物工程和基因工程创造出一些新的抗菌肽，所获得的产品对各种革兰氏阳性菌和阴性菌、真菌也具有较好抗性，甚至表现出比天然抗菌肽更优秀的抗菌活性。如李国栋等人利用Cecropin A1的N端1－ 8序列KWKLFKKI，另加一段标准的α－螺旋结构序列合成了l5条新的抗菌肽。经试验证明部分含有核心标准螺旋结构的序列，对革兰氏阳性菌和阴性菌的最小抑菌浓度仅是原有Cecropin A1抗菌肽的1/100左右[27]，说明部分新合成的抗菌肽活性得到了提高，抗菌活性得到增强。
3 抗菌肽分类
自从发现抗菌肽后，不同的学者根据当时认识水平和研究需要将其做了多种分类。而随着发现抗菌肽的种类越来越多，对其氨基酸数量、排布和二、三级空间结构也逐渐了解，学者们对抗菌肽的分类也随之发生相应改变。除以上按来源和分布外，在抗菌肽研究过程中还主要包含了以下几种分类方法。
3．1 1995年Boman分类法
1995年，Boman根据当时研究现状，基于抗菌肽结构相似性，按有无分子内二硫键，将其简单分为2类，其中没有分子内二硫键的抗菌肽有2类很容易识别：一类大部分包含了α－螺旋结构或直线肽，比如人类FALL－39（后来被命名为L－37）、牛的BMAP－27/28等；另一类也没有二硫键，但是其结构中包含了大量1、2种特定氨基酸残基（如脯氨酸和精氨酸），如牛的indolicidin和猪的PMAP－23[28]。
3．2 按化学组成、二级或三级空间结构
1996年， Hoffman曾将抗菌肽简单分为线肽和环肽，在这之后的1998年，Boman等人[29]结合最近几年研究进展，按其化学组成、二级或三级空间结构以及功能将抗菌肽再次分为3类，即：①不含半胱氨酸的抗菌肽，如猪小肠内抗菌肽、大部分蛙类抗菌肽等。②含等量半胱氨酸的抗菌肽，如蛙的brevinins、鳖的tachplesin等。③富含1～2种氨基酸的线肽，如蜜蜂的apidaecin，以及一种叫做细菌菌素的抗菌肽。
3．3 按空间结构
2004年，Reddy KVR[30]根据抗菌肽结构研究新进展，将其分为4种，即：①α－螺旋抗菌肽，如两栖类的Magainins。②富含半胱氨酸的抗菌肽，如人类的HNP－1/2③β－折叠抗菌肽，如防御素类。④富含某种氨基酸的抗菌肽。
这种分类方式较上一种更为细化，能更为直白的表达抗菌肽的空间结构，是在抗菌肽结构研究深入后对其分类的一大进步。
3．4 植物抗菌肽分类
根据抗菌肽的作用位置及机理将可将植物源抗菌肽其分为3种[31]，即：①作用于微生物细胞壁的抗菌肽，如Hevein和Knottin等。②作用于微生物质膜的抗菌肽，如植物防御素类。③作用于微生物胞内受体的抗菌肽，如玉蜀黍种子中分离得到的zeamatin等。
该分类包含了已发现的植物源抗菌肽功能和作用机理的详细介绍，对未来植物源抗菌肽的结构和生物工程方面研究具有积极意义。
3．5 按氨基酸残基特点和二级结构
大致可以划分为4种，即：①α－螺旋结构的抗菌肽，如两栖类的Magainins。②β－折叠结构的抗菌肽，如防御素类和从鲑鱼中提取的hepcidin等。③线形结构的抗菌肽，如牛体内的indolicidin。④环状结构的抗菌肽，如来自刺肩蝽体内的thanatin。
在以上4种抗菌肽中，α－螺旋和β－折叠2种结构所占比重最大，占自然界中天然抗菌肽的80% 以上，除此以外，一些人工合成抗菌肽也适用于此分类法。因此它是目前应用得较多、接受较为广泛的一种分类方式。有学者提出应另加上一类含稀有被修饰氨基酸的抗菌肽，但未被广泛采纳，因为尽管抗菌肽氨基酸序列各不一样，但仍有一些共同的结构特征，如高含量的正电荷残基和形成两亲构象的结构，一般是α－螺旋和β－折叠，所以仍可归类与以上4种之一。
4 抗菌肽基本作用
4．1 杀菌和抑菌
抗菌肽从字面意思即可理解为抗菌的肽类抗生素，其对各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较高的活性，可以杀灭侵入宿主体内的细菌或者抑制细菌生长繁殖，这也是抗菌肽最基本的一个作用，如PR－39（Proline－arginine－rich）能明显抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和醋酸钙不动杆菌等4种革兰氏阴性菌，对巨大芽孢杆菌和化脓链球菌也能产生抑菌效果等[32]。
4．2 抗病毒
人们发现抗菌肽对各类细菌具有抗性后，又发现其对病毒具有抗性，这是抗菌肽的又一基本作用，如从嗜中性粒细胞中提取的Indolicidin在浓度为60 mg/mL～100mg/mL 的50%抑制剂量时对HIV－1型病毒（333 mg/mL）具有一定杀灭作用[33]；防御素能使单纯疱疹病毒（HSV）、水泡性口膜炎病毒（VSV）、流感病毒（IV）失活等[34]。
4．3 抗肿瘤
RINALDI A C[35]指出从欧洲林蛙（Rana temporaia）分离出来的temporin L能诱导肿瘤细胞坏死，能在一定程度上阻止肿瘤细胞扩散。抗菌肽该作用被发现后，学者们即在医学上进行了广泛研究。已有研究表明抗菌肽对人髓样白血病细胞K552株、艾氏腹水瘤EAC、人宫颈癌细胞HeLa、直肠癌HR8340及肝癌细胞BEL27402等具有杀伤作用，并一定程度的抑制巨嗜细胞淋巴瘤U937、人髓样白血病细胞K562、肉瘤细胞S180等多种离体癌细胞[36]。
5 抗菌肽在畜牧中的应用
抗生素在刚发现之后，曾被誉为20世纪最伟大的发现之一，其被广泛利用于医学、畜牧等行业。但随后出现的抗生素滥用现象，导致一些如超强耐药菌、高残留农产品的出现，严重威胁了人们的身体健康，使得人们的研究重心逐渐转移到一些具有广谱抗菌、低或无残留特性的添加剂上，抗菌肽则是其中之一。目前，抗菌肽在畜牧中的应用主要集中在以下两点。
5．1 作为畜禽药品，预防和治疗动物疾病
传统的抗生素是通过阻断大分子生物合成来发挥作用，而抗菌肽的作用机制不同于传统抗生素，不易发生蓄积中毒，无致畸，不会导致抗药菌株的产生，因此它有望开发成为一类新型的多肽抗生素，而且这也是今后畜牧生产中的一个研究趋势。基于抗菌肽有良好的抗菌性能，所以可以将其作为动物疾病的有效预防和治疗药物，如用细菌素治疗奶牛乳头皮肤感染时，发现它在1 min内即可杀死金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌等病原菌，且无毒副作用；人工合成的CAP－18对绿脓杆菌引起的腹部感染有疗效，protegrin能抑杀对二甲氧基苯青霉素产生耐药性的金黄色葡萄球菌等[37，38]。
5．2 作为饲料添加剂
抗菌肽未来在畜牧生产中最大的作用就是作为饲料添加剂，提高动物免疫力、预防动物疾病和促进动物健康生长。由于抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，所以规模化发酵生产时，经高温浓缩工序不会导致抗菌肽失活，且抗菌肽具有可大规模生产，周期短、成本低、不受季节和气候变化影响等优点，这使得抗菌肽在此类研究中成为热点。如陈晓生等人[39]于肉鸭日粮中添加液体的蚕抗菌肽AD－酵母制剂发现，其血清代谢激素的活动显著增强、IGF－1浓度升高、营养物质合成加强、甲状腺素T3升高，脂肪、T4降低、尿素氮浓度显著降低、体内氮排出减少。缪小群[40]等人则进一步证明在提高肉鸭生产性能方面抗菌肽可以替代金霉素，蚕抗菌肽AD－酵母制剂在日粮中的最理想剂量是3 L/t。
此外，各国学者还利用基因技术进行抗菌肽的转基因动植物或产品生产，已经在小鼠、烟草、马铃薯等物种上获得成功，增强了其抗菌能力，改善了其生产性能，这也是未来抗菌肽研究的重中之重。
6 结 语
目前，人们已从自然界生物中提取出了大量天然抗菌肽，人工合成抗菌肽也处于积极研究之中。因抗菌肽在抗菌、抑菌、抗病毒和抗肿瘤等一系列方面有积极作用，各国学者正广泛利用基因和生物工程技术体外合成和转导表达抗菌肽，各种产品也不断面市，但是该技术必需建立在对其结构详细了解的基础上。为了更好的研究和比对抗菌肽，寻找其结构与功能关系，国外学者在总结各类抗菌肽后，建立了多个抗菌肽数据库（APD：Antimicrobial Peptide Database），如美国University of Nebraska Medical Center的APD，Zhe Wang[41]等人对其作用和分类进行了详细叙述。该数据库包含了525种抗菌肽的详细信息（其中有498种可抗细菌，155种可抗真菌，25种可抗病毒和18种可抗肿瘤）。除此之外，英国、芬兰和新加坡等均建立有数据库，有兴趣的读者可以登陆相关网站查询。应当注意到的是，尽管抗菌肽作用众多，但是对其作用机理仍然不是很清楚，导致说法不一，解释也多种多样，抗菌肽基因工程中一些关键技术，如纯化品的提取、受体和抗菌肽基因更好融合等方面仍有所欠缺，所以这方面仍需进一步研究。相信随着抗菌肽研究的深入，待其的各项研究取得进一步发展的时候，必将在食品、医疗、畜牧和各项农业等方面产生深远影响和积极推动作用，为人类造福！
湖南农业大学动物营养研究所
摘要：抗菌肽是动物体以及人类自身免疫系统中重要的组成部分。自从上个世纪70年代初由瑞典科学家Boman HG首次发现后，人们逐渐开始关注这一具有广谱抗菌性能，且相对于抗生素具有高效和无残留等显著优点的抗菌物质。随着对其研究深入，人们对抗菌肽的分布、结构和作用有了很大认识，并根据需要进行了分类。本文主要介绍抗菌肽的来源及其各自结构、分类的研究进展等，为今后的研究和学习提供借鉴。
关键词：抗菌肽；研究进展；畜牧业
Advance in the research of Antimicrobial protein and its application in animal husbandry
Peng Huilin Luo Zhenfu He jianhua
（College of Animal Science and Technology of Hunan Agricultural University， Chang Sha， Hu Nan， 410128）
Abstract： Antimicrobial peptide was an important ingredient of animal and human immune system． Since discovered by Boman HG of Sweden in 1970s， this antibiotic substance with broad－spectrum antibiosis which was no－residual and more efficient compared to antibiotic was becoming being concerned gradually． As the study went further， people had known much more disposition， structure and function of antimicrobial peptide than before， and then classified them by requirement． The advance of resource， classification，construction of antimicrobial peptide and its application in animal husbandry were mainly introduced in this paper， which could provide the later study with some experience．
Keyword： antimicrobial peptide；advance；animal husbandry
1 前言
抗菌肽（antimicrobial peptide）又称抗菌生物肽或肽抗菌素，在生物体内广泛存在，是生物体用来抵制外来入侵病原体，具有抗菌作用的一类小分子蛋白质。世界上第一个被发现的抗菌肽是20世70年代瑞典科学家Boman HG在用大肠杆菌诱导惜古比天蚕（Hyatophora cecropia）时分离得到的，命名为天蚕素（cecropin） [1]。此后到现在的30多年时间里，人们相继从微生物、两栖类动物、植物、哺乳动物和人类中发现并分离获得具有类似性质的活性多肽，至今已从自然界中发现超过900多种，且每年都以较高的速度增长[2]。
抗菌肽分子量小，具有等电点高、热稳定好和广谱抗菌等特点，不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有较强的杀灭作用，对某些真菌和耐药性细菌也具有杀灭作用。其在自然界中广泛存在，且在各种物种中的含量和结构不尽相同，加之抗菌肽具有优良的抗菌性能，学者们一直在探索利用生物和基因工程大量获得该物质，这都使得其成为当前各国研究的热点之一。
本文综述了近年来各国学者在自然界各种生物中发现的一些主要抗菌肽种类，结合以往研究成果，介绍了各种抗菌肽的基本结构和特点，主要论述其来源和分类研究进展，为今后开展抗菌肽生物和基因工程研究提供经验和借鉴。
2 抗菌肽分布及其结构
目前，在各种原核生物和真核生物中均有抗菌肽存在的报道，现将已发现的、并作为研究重点的一些主要抗菌肽及其结构按来源分述如下。
2．1 昆虫源抗菌肽
从发现第一个昆虫抗菌肽——天蚕素以来，人们已从昆虫体内分离提取出超过170种抗菌肽，其中研究得最为广泛的是天蚕素及昆虫防御素。天蚕素是3种蚕（Hyalophora cecropia， Antheraea pernyi and Bombyx mori）免疫应答反应的主要组成部分，分为天蚕素A、B、D3种，包含35～38个不等的氨基酸残基。通过序列分析和环二色性测定，所有天蚕素二级结构含有一个螺旋－卷曲－螺旋结构，这一点在天蚕素A上已经通过核磁共振分析得到证明，其－NH2末端螺旋含有一个有效静电荷（天蚕素A为6个），呈兼性，而－COOH末端螺旋电荷相对较弱，更具疏水性，其单环由在所有天蚕素中都是保守的Gly23和Pro24 2个氨基酸残基连接[3]。
昆虫防御素类（Defensin type）则是由29～40个氨基酸残基组成的多种阳离子肽，分子量4kD左右，具有特征性的反向平行β－折叠结构，富含Cys。在现实生活中，大部分昆虫防御素都是由试验感染动物的淋巴分离获得，然而对于蝎子、白蚁和软体动物门这三类，它却可以存在于非感染动物的颗粒型血细胞中。所有的昆虫防御素都有一个共同的6个半胱氨酸基序列，形成3个分子内二硫键，对革兰氏阳性菌有强的抗性，但是对革兰氏阴性菌的抗性则较弱。如从果蝇属中分离的抗菌多肽drosomycin、从麻蝇中分离出的holotricin、以及昆虫抗菌肽metchnikowin和thanatin等。
2．2 植物源抗菌肽
植物抗菌肽是植物自身合成的能够防御环境中微生物侵害的一类小分子多肽。目前已发现8个家族的植物抗菌肽，分别是是硫素（thionins）、植物防御素（plant defensins）、脂转移蛋白（lipid transfer proteins）、橡胶蛋白类（hevein－1ike peptides）、打结素类（knottin－like peptides）、凤仙花素（IbAMP）、蜕皮素（snakins）以及MBP1，其大小从2KD～9 kD不等。
在植物中发现的抗菌肽几乎都属于二硫键铰链多肽，富含半胱氨酸，并且所有的半胱氨酸都形成分子内二硫键，它们大都是阳离子多肽，有较好的热稳定性。其中研究比较广泛的是植物防御素，MENDEZE[4]等人于1990年首次从大麦、小麦种子中分离出植物该物质，并命名为γ－thionins，随后因发现与哺乳动物和昆虫的防御素结构有很大相似性，故重新命名为植物防御素。THOMMABP[5]经分析各类植物防御素发现分子量一般在5KD左右，一般含有45～54个氨基酸残基，且其中所含的Cys是高度保守的。典型的植物防御素包括一段3条链的反平行的β－折叠和一段α－螺旋，其中α－螺旋中的CXXXC片断的Cys通过分子内二硫键与C末端β链的CXC片断中的Cys相连，BONMATIN J M[6]证明其结构模型与昆虫防御素相同。
此外，Bruno P A[7]等人从紫茉莉中分离提取出2种植物抗菌肽，命名为MJ－AMP1和MJ－AMP2，分别由37和36个氨基酸残基构成，二者都含有3个二硫键，且仅存在4个氨基酸序列的差异。经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现它们可以由原始形态凝聚成为二聚物，表现出广谱抗菌性能。
2．3 微生物源抗菌肽
微生物抗菌肽是微生物分泌的用以保护自身，杀灭或抑制其它细菌、真菌等的小分子多肽，包括环形肽、糖肽和脂肽，如短杆菌肽、杆菌肽、多黏菌素肽和乳酸链球菌肽等[8]。无论由何种微生物合成或分泌，微生物源抗菌肽都有一些共同个特点，即：一般含有10～20个不等的氨基酸残基，分子量为3000Da左右（只有极少数超过9000Da）。其中由乳酸菌（1actic acid bacteria，LAB）产生的细菌素和由木霉属土壤真菌非核糖体肽合成酶（non－ribosomal peptide synthetase NRPS）合成的Peptaibol是目前研究得最多、最深入的微生物抗菌肽。Twomey D[9]指出由乳酸菌产生的乳酸菌球菌肽A、Z、3147含有33～36个氨基酸残基不等，分子量分别为为3353、3330、3323。Chugh JK等人将现有的Peptaibol分为9个亚类后，通过序列组成分析，发现所有的Peptaibol都含有40%的α－氨基异丁酸（AIB），C末端为氨基醇的肽，分子长度在5－20残基之间，多数为l5～20残基[10]。如今，随着人们对抗菌肽研究深入，有越来越多的微生物源抗菌肽被发现，如芽胞杆菌（Bacillus suhtilis Jm4）产生的Subpetin JM 4－A/B、鼠链球菌（Streptococcus rattus）产生的BHT－A/B、蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii ST4V）产生的Peptide St 4 V、短链球菌（Streptococcus boyis HjS/ Hc5）产生的Bovicin HJ 50/HC 5[11－15]。
2．4 两栖类源抗菌肽
1987年Zasloff发现了第一个两栖类抗菌肽，并命名为Magainins，它是爪蟾产生一类含有21～27个氨基酸残基的碱性元半胱氨酸的抗菌肽[16]，也是目前研究得较多的一类两栖抗菌肽。Maria Luisa Mangoni[17]等人以Rana esculenta为试验对象检验抗菌肽的分泌，结果表明，两栖动物皮肤腺可以分泌大量抗菌肽，但是其在无菌状态下是不分泌的，需经过微生物的刺激，且那些在普通环境下的蛙腺细胞具有可再生的能力，那些在无菌环境下处理过的蛙腺细胞则不具备此能力。MSI－78和MSI－594是Magainin的两种衍生类似物，前者氨基酸序列经测定为GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK－NH2，含有9个单位阳离子电荷，后者序列则为GIGKFLKKAKKGIGAVLKVLTTGL－NH2，含有6个单位阳离子电荷[18] ，二者都具有较好的抗菌性能。
从目前发现、分离的两栖类抗菌肽和以往的研究来看，其主要来源是蛙类和泥鳅等易于实验的动物，且几乎所有已发现的两栖类抗菌肽一级结构都得到了分析，氨基酸残基数集中在20－35个之间（少数抗菌肽残基数超过了40）。除Distinctin以外，两栖类抗菌肽均为单链肽，含有较多的亮氨酸和异亮氨酸残基，属于疏水肽，同时也含有一些精氨酸和赖氨酸残基，因而又属于阳离子肽。
2．5 哺乳动物（除人以外）源抗菌肽
哺乳动物的抗菌肽广泛存在于嗜中性白细胞、肠道黏膜和皮肤等位置。目前研究的重点主要集中在两类抗菌肽分子，一类是哺乳动物防御素，一类是Cathelicidin家族[19]。前者一般为3～4kD的阳离子小肽，由6个半胱氨酸组成链内二硫键和杀菌机制相关的双亲性分子结构，相比之下，后者则结构简单，不含半胱氨酸，为线性分子。
有学者根据肽链长度、氨基酸序列同源性、基因结构和表达位点，β－防御素可分为两种，第一种为含68～69个氨基酸残基的前体肽，且每个残基均含有一个内含子大于6．5Kb的相关基因。第二种则少5～6个残基，每个残基含有一个内含子小于2Kb且连接十分紧密的基因。但因很多抗菌肽基因家族存在明显的中间差异，此分类仍有待商榷。
此外，还有一些猪体抗菌肽也备受人们关注，如从猪小肠纯化的NK－lysin、PR－39和由猪白细胞提取的Protegrins（PGs），它们分别含有78、39、16～18个氨基酸残基，分子量从3339Da～8294Da不等，对各种病原菌都有明显的杀灭作用[20，21]。
2．6 水产类抗菌肽
从以往的研究看，水产中发现的抗菌肽主要集中在鱼、虾类，且发现的数量远不及其它物种。但是与其它来源抗菌肽相比，水产类抗菌肽具有溶血效应小，种类多样化等优点，表现出更强的杀菌作用和比其它种类更具优势的应用前景。目前，从南美白对虾中（Shrimp Penaeus vannamei）提取的Penaeidins是发现得较早且研究得最深入的水产类抗菌肽，其成熟分子大约由52－60个氨基酸残基组成，含有较多的阳离子，N端富含脯氨酸，C端由3个分子内二硫键维持稳定[22]。 Delphine Destoumieux[23]等人指出抗菌肽Penaeidins产生并储存于虾类的粒性白细胞中，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性，一旦遇微生物的刺激即可释放出来发挥作用。
水产类抗菌肽一般由20～60个氨基酸残基组成，分析各国学者已报道的序列，发现这些多肽氨基酸序列间的同源性较低，种间差异极大，但也存在一些共同特征，即：含有较多精氨酸或赖氨酸、分子带正电、含有较多疏水氨基酸、可使分子折叠成疏水或双亲性α螺旋结构等。
2．7 人类源抗菌肽
人类抗菌肽结构类似于其它哺乳动物抗菌肽，具有很大的同源性，但数量较之要少得多。目前其研究主要集中在2种，一种是Cathelicidin家族，另外一种是防御素。前者在人体内仅有一种——LL－37，由hCAP－18（Human cathelicidin antimicrobial peptide 18）经丝氨酸蛋白酶3水解产生 [24]，含有37个氨基酸残基，N－端前2个残基为亮氨酸。而人类防御素（hBD）则分为α（10种）、β（4种）两类，德国人Harder J于1997年首次发现hBD－2，其属于β－防御素类，分子由41个氨基酸残基构成，含有较多正电荷，肽链折叠形成3个β－片层结构，由6个半胱氨酸残基形成3个二硫键稳定结构[25]。hBD－1结构与hBD－2类似，但只由36个氨基酸残基组成，属于短肽[26]。
无论是Cathelicidin家族还是人类防御素，其分子量都集中在3～4KD之间，属于阳离子肽，能在体内形成一层保护屏障，是人类免疫系统的重要组成部分。
2．8 人工合成抗菌肽
除了以上从自然界发现的天然抗菌肽，人们还通过生物工程和基因工程创造出一些新的抗菌肽，所获得的产品对各种革兰氏阳性菌和阴性菌、真菌也具有较好抗性，甚至表现出比天然抗菌肽更优秀的抗菌活性。如李国栋等人利用Cecropin A1的N端1－ 8序列KWKLFKKI，另加一段标准的α－螺旋结构序列合成了l5条新的抗菌肽。经试验证明部分含有核心标准螺旋结构的序列，对革兰氏阳性菌和阴性菌的最小抑菌浓度仅是原有Cecropin A1抗菌肽的1/100左右[27]，说明部分新合成的抗菌肽活性得到了提高，抗菌活性得到增强。
3 抗菌肽分类
自从发现抗菌肽后，不同的学者根据当时认识水平和研究需要将其做了多种分类。而随着发现抗菌肽的种类越来越多，对其氨基酸数量、排布和二、三级空间结构也逐渐了解，学者们对抗菌肽的分类也随之发生相应改变。除以上按来源和分布外，在抗菌肽研究过程中还主要包含了以下几种分类方法。
3．1 1995年Boman分类法
1995年，Boman根据当时研究现状，基于抗菌肽结构相似性，按有无分子内二硫键，将其简单分为2类，其中没有分子内二硫键的抗菌肽有2类很容易识别：一类大部分包含了α－螺旋结构或直线肽，比如人类FALL－39（后来被命名为L－37）、牛的BMAP－27/28等；另一类也没有二硫键，但是其结构中包含了大量1、2种特定氨基酸残基（如脯氨酸和精氨酸），如牛的indolicidin和猪的PMAP－23[28]。
3．2 按化学组成、二级或三级空间结构
1996年， Hoffman曾将抗菌肽简单分为线肽和环肽，在这之后的1998年，Boman等人[29]结合最近几年研究进展，按其化学组成、二级或三级空间结构以及功能将抗菌肽再次分为3类，即：①不含半胱氨酸的抗菌肽，如猪小肠内抗菌肽、大部分蛙类抗菌肽等。②含等量半胱氨酸的抗菌肽，如蛙的brevinins、鳖的tachplesin等。③富含1～2种氨基酸的线肽，如蜜蜂的apidaecin，以及一种叫做细菌菌素的抗菌肽。
3．3 按空间结构
2004年，Reddy KVR[30]根据抗菌肽结构研究新进展，将其分为4种，即：①α－螺旋抗菌肽，如两栖类的Magainins。②富含半胱氨酸的抗菌肽，如人类的HNP－1/2③β－折叠抗菌肽，如防御素类。④富含某种氨基酸的抗菌肽。
这种分类方式较上一种更为细化，能更为直白的表达抗菌肽的空间结构，是在抗菌肽结构研究深入后对其分类的一大进步。
3．4 植物抗菌肽分类
根据抗菌肽的作用位置及机理将可将植物源抗菌肽其分为3种[31]，即：①作用于微生物细胞壁的抗菌肽，如Hevein和Knottin等。②作用于微生物质膜的抗菌肽，如植物防御素类。③作用于微生物胞内受体的抗菌肽，如玉蜀黍种子中分离得到的zeamatin等。
该分类包含了已发现的植物源抗菌肽功能和作用机理的详细介绍，对未来植物源抗菌肽的结构和生物工程方面研究具有积极意义。
3．5 按氨基酸残基特点和二级结构
大致可以划分为4种，即：①α－螺旋结构的抗菌肽，如两栖类的Magainins。②β－折叠结构的抗菌肽，如防御素类和从鲑鱼中提取的hepcidin等。③线形结构的抗菌肽，如牛体内的indolicidin。④环状结构的抗菌肽，如来自刺肩蝽体内的thanatin。
在以上4种抗菌肽中，α－螺旋和β－折叠2种结构所占比重最大，占自然界中天然抗菌肽的80% 以上，除此以外，一些人工合成抗菌肽也适用于此分类法。因此它是目前应用得较多、接受较为广泛的一种分类方式。有学者提出应另加上一类含稀有被修饰氨基酸的抗菌肽，但未被广泛采纳，因为尽管抗菌肽氨基酸序列各不一样，但仍有一些共同的结构特征，如高含量的正电荷残基和形成两亲构象的结构，一般是α－螺旋和β－折叠，所以仍可归类与以上4种之一。
4 抗菌肽基本作用
4．1 杀菌和抑菌
抗菌肽从字面意思即可理解为抗菌的肽类抗生素，其对各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较高的活性，可以杀灭侵入宿主体内的细菌或者抑制细菌生长繁殖，这也是抗菌肽最基本的一个作用，如PR－39（Proline－arginine－rich）能明显抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和醋酸钙不动杆菌等4种革兰氏阴性菌，对巨大芽孢杆菌和化脓链球菌也能产生抑菌效果等[32]。
4．2 抗病毒
人们发现抗菌肽对各类细菌具有抗性后，又发现其对病毒具有抗性，这是抗菌肽的又一基本作用，如从嗜中性粒细胞中提取的Indolicidin在浓度为60 mg/mL～100mg/mL 的50%抑制剂量时对HIV－1型病毒（333 mg/mL）具有一定杀灭作用[33]；防御素能使单纯疱疹病毒（HSV）、水泡性口膜炎病毒（VSV）、流感病毒（IV）失活等[34]。
4．3 抗肿瘤
RINALDI A C[35]指出从欧洲林蛙（Rana temporaia）分离出来的temporin L能诱导肿瘤细胞坏死，能在一定程度上阻止肿瘤细胞扩散。抗菌肽该作用被发现后，学者们即在医学上进行了广泛研究。已有研究表明抗菌肽对人髓样白血病细胞K552株、艾氏腹水瘤EAC、人宫颈癌细胞HeLa、直肠癌HR8340及肝癌细胞BEL27402等具有杀伤作用，并一定程度的抑制巨嗜细胞淋巴瘤U937、人髓样白血病细胞K562、肉瘤细胞S180等多种离体癌细胞[36]。
5 抗菌肽在畜牧中的应用
抗生素在刚发现之后，曾被誉为20世纪最伟大的发现之一，其被广泛利用于医学、畜牧等行业。但随后出现的抗生素滥用现象，导致一些如超强耐药菌、高残留农产品的出现，严重威胁了人们的身体健康，使得人们的研究重心逐渐转移到一些具有广谱抗菌、低或无残留特性的添加剂上，抗菌肽则是其中之一。目前，抗菌肽在畜牧中的应用主要集中在以下两点。
5．1 作为畜禽药品，预防和治疗动物疾病
传统的抗生素是通过阻断大分子生物合成来发挥作用，而抗菌肽的作用机制不同于传统抗生素，不易发生蓄积中毒，无致畸，不会导致抗药菌株的产生，因此它有望开发成为一类新型的多肽抗生素，而且这也是今后畜牧生产中的一个研究趋势。基于抗菌肽有良好的抗菌性能，所以可以将其作为动物疾病的有效预防和治疗药物，如用细菌素治疗奶牛乳头皮肤感染时，发现它在1 min内即可杀死金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌等病原菌，且无毒副作用；人工合成的CAP－18对绿脓杆菌引起的腹部感染有疗效，protegrin能抑杀对二甲氧基苯青霉素产生耐药性的金黄色葡萄球菌等[37，38]。
5．2 作为饲料添加剂
抗菌肽未来在畜牧生产中最大的作用就是作为饲料添加剂，提高动物免疫力、预防动物疾病和促进动物健康生长。由于抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，所以规模化发酵生产时，经高温浓缩工序不会导致抗菌肽失活，且抗菌肽具有可大规模生产，周期短、成本低、不受季节和气候变化影响等优点，这使得抗菌肽在此类研究中成为热点。如陈晓生等人[39]于肉鸭日粮中添加液体的蚕抗菌肽AD－酵母制剂发现，其血清代谢激素的活动显著增强、IGF－1浓度升高、营养物质合成加强、甲状腺素T3升高，脂肪、T4降低、尿素氮浓度显著降低、体内氮排出减少。缪小群[40]等人则进一步证明在提高肉鸭生产性能方面抗菌肽可以替代金霉素，蚕抗菌肽AD－酵母制剂在日粮中的最理想剂量是3 L/t。
此外，各国学者还利用基因技术进行抗菌肽的转基因动植物或产品生产，已经在小鼠、烟草、马铃薯等物种上获得成功，增强了其抗菌能力，改善了其生产性能，这也是未来抗菌肽研究的重中之重。
6 结 语
目前，人们已从自然界生物中提取出了大量天然抗菌肽，人工合成抗菌肽也处于积极研究之中。因抗菌肽在抗菌、抑菌、抗病毒和抗肿瘤等一系列方面有积极作用，各国学者正广泛利用基因和生物工程技术体外合成和转导表达抗菌肽，各种产品也不断面市，但是该技术必需建立在对其结构详细了解的基础上。为了更好的研究和比对抗菌肽，寻找其结构与功能关系，国外学者在总结各类抗菌肽后，建立了多个抗菌肽数据库（APD：Antimicrobial Peptide Database），如美国University of Nebraska Medical Center的APD，Zhe Wang[41]等人对其作用和分类进行了详细叙述。该数据库包含了525种抗菌肽的详细信息（其中有498种可抗细菌，155种可抗真菌，25种可抗病毒和18种可抗肿瘤）。除此之外，英国、芬兰和新加坡等均建立有数据库，有兴趣的读者可以登陆相关网站查询。应当注意到的是，尽管抗菌肽作用众多，但是对其作用机理仍然不是很清楚，导致说法不一，解释也多种多样，抗菌肽基因工程中一些关键技术，如纯化品的提取、受体和抗菌肽基因更好融合等方面仍有所欠缺，所以这方面仍需进一步研究。相信随着抗菌肽研究的深入，待其的各项研究取得进一步发展的时候，必将在食品、医疗、畜牧和各项农业等方面产生深远影响和积极推动作用，为人类造福！