关键词 豆粕；发酵；蛋白肽；蛋白酶；益生菌
中图分类号 TQ920.6
豆粕是目前畜牧养殖业使用量很大的一种优质蛋白源。与棉粕、菜粕、花生粕相比，豆粕的赖氨酸含量高(接近理想氨基酸模式)、消化率高(85%)、适口性好；与动物源蛋白（如鱼粉、肉骨粉、血浆蛋白粉等）相比，豆粕货源充足，不易被病原菌污染、不易氧化腐败，含毒害物质少、安全系数高。但是，豆粕中也含有一些抗营养因子，如胰蛋白酶抑制因子等，这些抗营养因子对幼龄动物特别是断奶仔猪的肠道结构具有很大的破坏作用，并带来仔猪腹泻等疾病的发生。因此，在断奶仔猪配合饲料中豆粕的添加比例一般认为不宜超过10%，最多只能添加15%。豆粕蛋白质含量一般为43％～45%，当添加比例为15%时，仔猪饲料中的蛋白质含量也只有6.45％～6.75%，而仔猪饲料蛋白质需求量为17％～21%，不足部分只能使用高价位的蛋白原料，如进口鱼粉、血浆蛋白粉、肠绒膜蛋白、氨基酸、乳制品等，这些紧缺、稀少蛋白源的使用大大提高了饲料配方成本和动物饲养成本。因此，为了开发价廉的优质蛋白源，人们进行了多年的研究探索。研究表明[1-3]，微生物发酵法是去除豆粕中抗营养因子（如大豆球蛋白、?茁-聚球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、热稳定大豆寡糖等）的有效方法之一，而且发酵产品中含有蛋白酶、益生菌、有机酸及小分子肽等未知生长因子。本研究利用多株对畜禽有益的微生物发酵豆粕，对豆粕发酵产物的多项指标进行了对比，以期为更好的开发利用豆粕这种优质植物蛋白源提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 菌种及试验材料
豆粕为市场采购；微生物菌株(嗜酸乳杆菌1.2624、米曲霉3.042)均购自中国科学院微生物研究所菌保中心，纳豆芽孢杆菌P2为实验室从豆类发酵制品中自主分离并保存的两株芽孢杆菌；小分子量标准蛋白质（Marker）购自中国科学院上海生物化学研究所；电泳药品、分析药品均由化学试剂商店购买或代购。
1.2 仪器设备
LDZX-40立式普通压力灭菌锅、LH4131L大容量离心机、MIKRO 22R台式冷冻离心机、FD-1冷冻干燥机、JY300电泳仪、T6紫外可见分光光度计、SW-CJ-1CU双人水平洁净工作台、SHY-2恒温水浴振荡器、JA1103N电子天平、PHS-25精密酸度计、Uvpro Silver GAS7300凝胶成像分析系统、XSP-BM-10CA生物显微镜、凯氏定氮装置、Socorex可调式移液器、C-20K61微电脑电磁炉、QXK医用血球计数板、新飞牌-221 L冰箱。
1.3 液体培养基
①嗜酸乳杆菌培养基：西红柿汁10%、酵母膏0.75%、葡萄糖1%、蛋白胨0.75%、磷酸二氢钾0.2%、Tween80 0.05%、水100 ml，pH值7.0。②芽孢杆菌培养基：酵母膏0.5%、葡萄糖3%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.05%、氯化钠 0.01%、碳酸钙2.2%，自然pH值。③米曲霉培养基：麸皮100%、水适量，自然pH值。以上培养基均在121 ℃下放置20 min，冷却备用。
1.4 发酵培养
使用饲用的纯豆粕进行发酵试验，调节培养基料水比为1：1，接种量为0.5%。每个三角瓶（250 ml）装培养基10 g，接种后混合均匀，32 ℃静置培养。
1.5 发酵产物分析
发酵结束后，取发酵豆粕和未发酵豆粕各5 g,冷冻干燥机干燥24 h。然后用凯氏定氮法[4]进行粗蛋白的测定。按发酵豆粕与蒸馏水之比1：8(m/v)的比例稀释,用小型高速粉碎机粉碎30 s,4 000 r/min离心5 min,轻轻摇动离心管，倒出上清液，进行下列项目的测定。
小分子肽含量分析：采用75%乙醇沉淀法[5]。
蛋白酶活性测定：采用福林-酚试剂法，参照工业酶制剂通用试验方法 QB/T1803—93，略有改动。以pH值5.0、40 ℃水浴保温30 min时，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个酶活性单位(U)。
益生菌计数：取上清液，适当稀释后采用血球计数板进行计数。
pH值测量：取上清液，添加蒸馏水配成10%水溶液，用酸度计进行pH值测量。
发酵蛋白肽的电泳分析：①凝胶制备采用分离胶和浓缩胶组成的凝胶板。下层为分离胶,含丙烯酰胺12％～15%；上层为积层胶,含丙烯酰胺5％。②加样。取发酵豆粕和对照组上清液各100 μl,加同样体积的2倍溴酚蓝上样液,混匀,用微量进样器取混合液20 μl加于凝胶的每个凹槽中。③电泳。在电泳槽中分别注入Tris-甘氨酸缓冲液,控制电泳电流、电压为40～50 mA、300 V；电泳约1.5 h后结束电泳,0.25%考马斯亮蓝染色,甲醇－冰醋酸脱色，将凝胶板放入凝胶成像系统进行照相与分析。
2 结果与分析
2.1 豆粕发酵前后的电泳图谱（见图1）
由图1可以看出，豆粕发酵前后的电泳图谱显著不同。发酵前豆粕蛋白质分子量较大，且分带现象明显；发酵后具有抗营养作用的大分子蛋白质（如大豆球蛋白、?茁-聚球蛋白等）含量显著减少，几乎全部被分解为小分子蛋白或小分子肽。本研究选取的几株有益微生物均具有较强的分泌蛋白酶的活力，经过30多小时的发酵作用不仅可以降解抗营养球蛋白，而且将分子量在20.1～97.4 kD之间的大分子豆粕蛋白几乎全部分解；发酵豆粕中含有大量分子量在20.1 kD以下的小分子蛋白或小分子肽。
2.2 豆粕发酵后理化与生化指标的变化（见表1）
从表1可以看出，3株菌都具有较高的产蛋白酶的能力，以米曲霉酶活性最高。测定结果表明，豆粕经益生菌36 h发酵后，蛋白酶活性分别达到215、240和385 U/g；结合电泳图谱来看，本试验选择的几种益生菌（嗜酸乳杆菌、芽孢杆菌、米曲霉）都具有降解豆粕的显著作用，米曲霉降解豆粕的效果最好；芽孢菌发酵豆粕的能力也很强，并繁殖出大量的以芽孢形式存在的益生菌，这一特点对于发酵豆粕用于饲料饲喂畜禽十分有益，有利于调节畜禽胃肠道微生物菌群区系向着有益于畜禽健康的方向发展。豆粕在发酵后粗蛋白含量也有所提高，不过提高幅度不大，最多提高3.49％（嗜酸乳杆菌1.2624）。豆粕在发酵过程中还繁殖产生大量的益生菌，如嗜酸乳杆菌1.2624和纳豆芽孢杆菌P2发酵后的数量每克分别达到7.2×109个和4.3×109个，米曲霉可能是由于培养时间较短的原因而没有在发酵豆粕中检测出分生孢子。pH值在发酵前后的变化不大，以嗜酸乳杆菌最低（pH值6.0）。试验还对其它处理如灭菌方式及处理时间、离心力等因素影响豆粕发酵的效果进行了研究，结果发现，高压灭菌或常压处理对发酵豆粕色泽和电泳图谱有一定影响；离心力大小也影响电泳图谱的分析结果（结果未列出）。本试验采用乙醇离心沉淀法测小分子肽含量的结果稳定性较差，还需做进一步研究。
通过以上试验表明，乳酸杆菌、芽孢杆菌以及米曲霉菌都能够利用在发酵过程中自身分泌的酶特别是蛋白酶来分解豆粕的大分子蛋白质为小分子蛋白质或小分子肽，并繁殖产生大量的益生菌活菌细胞，这一特点对发酵豆粕及其肽类产品的推广应用非常重要；而且发酵工艺条件对豆粕发酵产品的商品价值具有重大影响。我们将在该项研究基础上，进一步开展豆粕发酵工艺技术的研究以及豆粕发酵制品应用于畜禽养殖业的实际效果的研究。
3 讨论与结论
关于发酵豆粕促进幼龄畜禽健康、提高生产性能的研究报道还不是很多。发酵豆粕的优点普遍认为是豆粕经过微生物发酵处理后消除了豆粕中的抗营养因子，豆粕大分子蛋白被降解成动物易消化吸收的小分子蛋白肽类物质，减少了对动物肠道绒毛结构的破坏，从而促进畜禽生产性能的提高[6-8]。本试验研究发现，发酵豆粕中不仅含有大量的益生菌、高活性蛋白酶，而且含有丰富的小分子蛋白肽；高分子蛋白抗营养因子被有效去除和显著降解。因此，经过微生物发酵的豆粕产品对提高畜禽的健康水平是十分有益的。相信随着豆粕发酵技术的完善与推广应用，微生物发酵产品特别是发酵豆粕作为一种货源充足的优质蛋白源，必将在未来规模化养殖业中发挥重要作用。
参考文献
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2 张丽英，谯仕彦，李德发， 等.特殊大豆蛋白HP300对断奶仔猪生产性能影响的研究[J]. 饲料研究, 2000（8）：12～14
3 李绍章，梁运祥，葛向阳. 大豆蛋白发酵降解多肽在养殖中的应用[J]. 饲料广角，2004（7）：36～39
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7 刘波，章世元，姜德兴，等. 饲料中的抗营养因子及处理方法[J]. 粮食与饲料工业，2003（2）：19～21
8 陈荣义，胡培全. 小肽营养在畜牧业中的应用[J]. 江苏农业科学, 2003（6）：92～96
（编辑：王 芳，xfang2005@163.com）
周伏忠，河南省微生物工程重点实验室，450008，郑州市花园路28号。
谢宝恩、贾蕴丽，单位及通讯地址同第一作者。
王红云，河南省科学院生物研究所。
收稿日期：2007-01-13
★ 2005年河南省转制科研机构专项资金项目（项目编号：0541070502）；2006年河南省科技攻关项目（项目编号：0624430015）