一、总体目标 本项目的总体目标是着力解决制约我国疫苗产业发展的关键生产技术，完善或建立疫苗关键性技术平台，发挥其示范作用，使我国疫苗大品种生产关键技术水平迈上新台阶，大幅度缩小与发达国家之间的差距。通过项目实施，提高紧缺疫苗大品种的产量，提高优势企业疫苗的质量，为疫苗行业的进一步集约化提供科技支撑；大力推动国际化进程，促进我国疫苗产品出口，提高我国疫苗产品在国际市场的占有率。 通过项目的实施，建立3-5个技术平台，突破5-10项关键技术，力争1-2个品种获得临床研究批件、2-3个品种获准换发生产文号，大幅度提高8-10种疫苗产品的产量，实现我国疫苗产业年销售收入新增8-10亿元。 二、实施年限 项目实施年限为2008年7月～2010年12月。 三、主要内容 课题1、细菌多糖-蛋白结合关键技术及其应用研究 1、研究内容 （1）研究多糖－蛋白质结合化学的适宜方法。利用具有代表性的Hib结合疫苗优化制备条件和结合物大规模纯化技术条件；优化Hib多糖衍生及多糖蛋白结合技术；解决Hib多糖活化、衍生，与载体蛋白结合过程中的条件优化，进行规模纯化层析条件的优化，最终使多糖-蛋白结合疫苗的产量提高，结合物原液质量指标稳定；建立Hib结合物原液、成品中结合物含量、成品中游离蛋白、游离多糖的快速、稳定的测定方法游离蛋白质和游离多糖含量的质量控制方法。 （2）细菌多糖蛋白质结合疫苗质量标准研究。主要包括多价结合疫苗和多联多价联合疫苗质量标准确立（多价疫苗中各种单价疫苗抗原含量检测，游离蛋白、游离多糖含量检测、多种抗原成分剂量、配伍研究，以及最低免疫剂量的确定等）。 （3）载体蛋白多样化研究。开发TT和DT以外的新载体蛋白质；对现有载体蛋白使用风险的评价，以及对新的载体进行安全性、有效性的全面评价研究，完成H21G、64K外膜蛋白、C5a肽酶等新型载体蛋白的特性研究；以及探索这些新型载体蛋白与细菌多糖结合的方法或工艺。 （4）细菌多糖蛋白质结合疫苗效果评价方法建立。包括： ①标准参考物质的制备； ②抗体含量检测方法建立与标准化； ③抗体功能活性检测方法建立与标准化。 2、考核指标 (1)技术指标 ① 建立600～1200升发酵罐的高密度发酵技术，使每批培养物获得的Hib粗多糖达到1000克以上，Hib纯化多糖达到60克以上； ②提高累计收率达到投入Hib多糖的12%以上；结合物原液及疫苗成品中游离多糖含量稳定在不高于10%；优化后的衍生、结合工艺使结合物中多糖的收率达到投入多糖的40%； ③多糖-蛋白结合疫苗：高分子量结合物含量≥75%～80%；纯化回收率≥35%～50%；结合物原液中游离蛋白含量低于总蛋白的5%；Hib纯化多糖的内毒素含量稳定在不高于10EU/ug多糖。提高稳定性，降低多糖和结合蛋白的解离和降解，2年有效期内疫苗游离多糖含量不高于15%，游离蛋白含量不高于5%； ④建立稳定、敏感、快速的游离多糖和蛋白质监测方法。按照国家标准制备出有关的标准参考物质（检定用标准菌株、细胞株，多糖、蛋白以及标准参考血清），抗体含量和抗体功能活性检测方法建立并能够标准化； ⑤探索基于高效液相色谱的游离蛋白、游离多糖测定方法，探索基于高效液相色谱的Hib多糖分子大小测定以及Hib多糖-蛋白结合物分子大小的检测方法，提高结合疫苗质量控制的水平； ⑥使我国的Hib结合疫苗的安全性和免疫原性与国家先进水平的同类产品具有可比性，且免疫后抗体GMC水平较高。 (2)经济指标 Hib疫苗产品的生产能力达到1000万剂量；销售量增加到600万剂量。 (3)加速和推进其它细菌多糖蛋白质结合疫苗研究开发中起到示范作用，如9价肺炎结合疫苗和4价流脑结合疫苗、伤寒Vi-rEPA结合疫苗、甲型副伤寒结合疫苗、痢疾结合疫苗，大肠杆菌结合疫苗等，力争1～2种产品获临床研究批件、2种产品完成临床试验或取得新药证书。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费1040万元，要求申报单位自筹经费不低于1040万元。 课题2、病毒性疫苗大规模培养技术研究 1、研究内容 规模化病毒与细胞培养技术研究。研究开发生物反应器微载体技术，进行哺乳类细胞规模化培养，大规模培养疫苗病毒。对于不适宜微载体培养技术或悬浮培养的细胞，则采用其它规模化培养技术。同时，兼顾具有我国自主知识产权的新型细胞基质的开发和研究。 细胞在生物反应器中培养特性的研究；细胞培养条件的研究，包括对溶氧、培养基成分、细胞代谢产物、生物反应器中微环境等对细胞生长的影响；不同细胞微载体的筛选对比研究。微载体与细胞相互影响因素的研究；建立生产规模的逐级放大方法，以达到百升以上规模；生物反应器的操控对细胞培养的影响。 建立高滴度病毒的增殖培养方法，确定最优的细胞与病毒培养方法及培养条件。研究多种病毒在生物反应器中的生长特点。 2、考核指标 （1）研究成果示范于其它大品种疫苗的生产和研究开发；着重应用于脊髓灰质炎病毒、乙脑灭活疫苗、狂犬病、风疹（2BS等二倍体细胞）、轮状病毒（vero）、水痘等多种病毒性疫苗的技术升级或产品开发。 （2）细胞病毒批次培养规模：生物反应器体积≥30升，力争使部分疫苗产品生产能力达到100升的规模。 （3）培养细胞密度≥1×107cells/ml；工作体积的微载体≥20g/l；培养病毒滴度不低于旋转培养技术。 （4）病毒感染后，细胞培养维持时间应≥20天，并能多次收获病毒；溶细胞性病毒除外。 （5）病毒滴度均高于《药典—三部》中规定的各种疫苗原液的标准。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费520万元，要求申报单位自筹经费不低于520万元。 课题3、疫苗抗原的高效表达技术及分离纯化技术应用研究 1、研究内容 利用基因工程技术改造菌毒种，筛选具有我国自主知识产权的高表达工程菌毒种, 建立汉逊酵母表达质粒和酵母工程细胞，以及酵母汉逊或毕赤酵母表达系统；提高现有重组疫苗工程菌毒种的表达量，以及改造抗原表达产物的形式；应用于构建高效的工程菌毒种表达乙型肝炎病毒亚单位疫苗抗原等，提高免疫原性，探索培养液的国产化，实现高密度发酵与高表达技术。 建立高效的疫苗抗原表达技术体系，包括普通抗原、结构复杂疫苗抗原等在内的抗原表达研究开发。利用基因工程技术构建重组疫苗抗原、新型载体蛋白用于结合疫苗；以中国绿脓杆菌优势感染毒株为亲本株构建系列脱毒的疫苗抗原组分，研制更为安全、有效的外毒素疫苗或有效的抗原载体；通过基因改造，建立汉逊酵母高效表达技术平台，并构建汉逊酵母表达人乳头瘤病毒疫苗；解决用一次性反应器系统培养昆虫细胞高效表达HPV疫苗的所有关键技术，建立通用的、实验条件达到规模化水平的细胞培养技术平台和疫苗生产工艺平台；应用基因工程构建呼吸道合胞病毒（RSV）G、F亚单位疫苗抗原等。 研究疫苗抗原的分离纯化技术，应用于基因重组表达表达疫苗抗原、其它亚单位抗原成分、载体蛋白等成分等的分离纯化，以及应用于纯化疫苗如Vero细胞培养灭活乙脑疫苗等产品的大规模纯化技术研究。 2、考核指标 （1）规模化培养水平 细菌的批次培养体积≥1000L；酵母的批次培养体积≥550L； 昆虫细胞批次培养体积≥50L； （2）疫苗抗原表达量 以原核表达体系其表达量超过35%；以酵母作为表达体系其疫苗抗原表达量超过100mg/L；实现工程菌抗原表达量颗粒状HBsAg表达量达100μg/ml发酵液，最终可得HBsAg颗粒状纯品30μg/ml发酵液； 以昆虫细胞作为表达体系，其抗原表达量超过10mg/L； （3）建立疫苗抗原的高效表达技术及规模化分离纯化技术，提高疫苗抗原纯度及回收率： ①杂蛋白去除率≥99%；或抗原纯度≥95%； ②细菌表达产物纯化回收率≥35%； ③病毒纯化后的回收率≥35% （4）提高疫苗抗原的比活性； （5）部分发酵原材料实现国产化； （6）产品指标： ①灭活乙脑病毒纯化回收率≥25%，每剂病毒蛋白含量≥2μg，实现年产1000万剂量； ②狂犬病病毒纯化回收率≥50%，每剂疫苗蛋白质含量≤65μg； ③单一厂家的乙肝疫苗实现年产不少于4000万人份。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费800万元，要求申报单位自筹经费不低于800万元。 课题4、扩大免疫规划疫苗规模化生产和升级换代关键技术研究 1. 研究内容 （1）脊髓灰质炎疫苗升级换代攻关研究 ①优化Sabin株制备脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV）的生产工艺，通过改进培养方法、优化培养参数，提高病毒产量。改进纯化工艺，提高产品回收率，降低产品的杂质含量。由中试规模放大到生产规模，进行I、II、III期临床研究。 ②液体疫苗取代糖丸疫苗的研究。 ③提高脊髓灰质炎疫苗质量标准，达到WHO标准。 ④疫苗剂型和剂量研究、原辅材料及包装材料国产化研究。 （2）无细胞百白破疫苗升级和生产关键技术研究 ①建立大规模自动化细菌发酵技术工艺，优化细菌培养条件，提高PT、FHA产量； ②优化现有离心共纯化法生产工艺。同时，采用超滤和一步柱层析法的纯化方法代替离心法用于百日咳菌有效抗原（PT、FHA）的纯化工艺，提高保护性抗原的纯度和收获率； ③优化和稳定百日咳抗原解毒条件，避免产生毒性逆转现象； ④疫苗中增加百日咳有效组份至至少三个组分（PT、FHA、Prn），以赶上国际同类产品并符合WHO要求； ⑤建立标准化的DTaP生产过程及中间产品、终产品的质量控制方法和指标，特别是有效抗原成分、活性和毒性检定项目要求； ⑥探索利用蛋白质工程技术构建疫苗抗原或抗原表位肽。 （3）麻腮风三联减毒活疫苗生产工艺优化和规模生产技术 ①制备高滴度的组分疫苗原液； ②疫苗病毒组分配比及冻干条件的优化； ③风疹和腮腺炎病毒毒种的克隆筛选。 （4）甲肝疫苗规模化生产技术研究 针对甲肝灭活疫苗或减毒活疫苗，开展： ①大规模病毒培养的研究； ②集约化生产的建立； ③疫苗生产质控用参比品及质量标准的研究，通过与WHO合作，向WHO申报并争取WHO授权制备疫苗的国际参比品，同时将灭活疫苗的质量标准与国外规程统一； ④优化甲肝灭活疫苗纯化工艺条件； ⑤优化冻干甲肝减毒活疫苗的组分配比及冻干条件，进一步缩短冻干周期时间，优化冻干保护剂的配比，进一步提高热稳定性； ⑥疫苗上市后的临床免疫效果评价。 2. 考核指标 （1）脊髓灰质炎疫苗升级换代攻关研究 ①按国家扩大免疫规划产品现行定价，较糖丸疫苗增加产值250%； ②使用国产塑料管包装的脊髓灰质炎液体疫苗符合国家标准； ③Sabin株IPV由中试规模放大到生产规模，使IPV制造技术达到国际先进水平； ④Sabin株IPV完成I、II临床研究，力争完成III期临床研究； ⑤连续生产三批合格疫苗，通过国家GMP认证，力争获得Sabin IPV的新药证书或生产文号。 （2）无细胞百白破疫苗升级和生产关键技术研究 ①产品质量达到国外同类产品的标准，进入国际市场；提高百日咳有效组份纯度至90%。力争达到由目前的百日咳菌二组份转换为多组份疫苗，增加有效组分至3组分（PT、FHA、Prn）。开发适合我国成人加强免疫用无细胞百日咳疫苗； ②细菌培养有效抗原的产量血凝效价由目前的1：64提高到1：512以上； ③建立和实现3000～5000升体积的自动化细菌发酵培养工艺； ④提高抗原纯化回收率，使成品单产量由现在的1人份/10ml提高到1人份/5ml； ⑤建立有效成分（PT、FHA、Prn）参考抗原、定量检测、分子分布的有效检测方法；建立疫苗效力评价的抗体滴度检测法。建立DTaP的标准化质量控制指标，特别是提高毒性检定项目要求，达到国际领先水平； ⑥年产量由目前约500万人份增加到约4000万人份，占国内需求量6400万的2/3以上。 （3）麻腮风三联减毒活疫苗生产工艺优化和规模生产技术 ①麻腮风三联疫苗原液中麻疹病毒滴度≥5.0 lgCCID50/ml、腮腺炎病毒≥6.0 lgTCID50/ml、风疹病毒≥5.0 lgCCID50/ml； ②确定最佳疫苗配比方案，保证免疫效果； ③实现年产3000万人份。 （4）甲肝疫苗规模化生产技术研究 ①在大规模、集约化生产基础上，保证疫苗质量达到国际标准，实现疫苗出口； ②达到年产3000万支甲肝疫苗。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费1600万元，其中：（1）脊髓灰质炎疫苗升级换代攻关研究部分拟安排国拨经费400万元，要求申报单位自筹经费不低于400万元；（2）无细胞百白破疫苗升级和生产关键技术研究部分拟安排国拨经费400万元，要求申报单位自筹经费不低于400万元；（3）麻腮风三联减毒活疫苗生产工艺优化和规模生产技术拟安排国拨经费400万元，要求申报单位自筹经费不低于400万元；（4）甲肝疫苗规模化生产技术研究部分拟安排国拨经费400万元，要求申报单位自筹经费不低于400万元。 课题5、乙型脑炎减毒活疫苗的国际GMP预认证研究 1、研究内容 （1）生产工艺和质量保证体系的进一步优化。 （2）SPF动物种质库保持和基因稳定性研究与检测方法建立及SPF动物大规模繁殖。 （3）加强上市后临床评价，海外市场的临床评价，适应国际化需要。 2、考核指标 （1）实现年产5000万人份乙脑减毒活疫苗，其中80%出口。 （2）2008年完成WHO GMP预认证。同时逐步实现全所所有生产、科研、动力供应、动物试验等场所（如其他GMP车间、冷库、孵室、动力检测计量等）的中央控制室集中监控。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费400万元，要求申报单位自筹经费不低于400万元。 课题6、23价肺炎疫苗规模化生产和质控关键技术研究 1、研究内容 （1）生产规模的放大和生产工艺的优化。提高细菌多糖产量和收获率，建立1000升以上发酵体积的高密度细菌发酵技术；提高纯化后获得的多糖回收率；对多糖纯化工艺进行优化，建立收率高、内毒素含量低的多糖纯化工艺。 （2）疫苗定性、定量检测用血清的国产化。 （3）制备与标定企业参考品和拟申报制备国家参比品。 （4）细菌多糖结合疫苗研究开发。 2、考核指标 （1）生产发酵培养由100升罐体放大到1000升；质量标准达到《欧洲药典》标准。 （2）产规模扩大后，实现年产500万人份23价肺炎多糖疫苗，年销售收入3.5亿元，市场占有率达到80%。 （3）使用国产血清（多抗和单抗）应用于产品的质量检测和控制；向国家有关部门申报并且协助中国药品生物制品检定所建立我国质量检定参比品和参考品；产品质量检定和控制使用的抗血清实现国产化，国产血清的效价不低于1：64。 （4）多价多糖结合疫苗完成临床研究，力争完成临床试验或获得新药证书。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费600万元，要求申报单位自筹经费不低于600万元。 课题7、流感裂解疫苗质量提高与规模化生产技术研究 1、研究内容 （1）大规模病毒培养技术研究和应用，提高单枚鸡胚的病毒产出量。 （2）生产工艺技术优化并验证抗原性和免疫原性。 （3）提高质量的有关技术研究，参照WHO和欧盟GMP要求，降低产品中有害成分如硫柳汞、内毒素、杂蛋白等的含量。 （4）提高疫苗稳定性，主要是提高血凝素的稳定性；针对WHO和欧盟标准，增加神经氨酸酶的定性测定等。 2、考核指标 （1）技术指标：在大规模、集约化生产基础上，保证疫苗质量达到国际标准，完善出口注册资料和数据，申报并通过WHO预认证，实现疫苗出口；完成不少于5个国家的注册，力争出口500-1000万人份。 （2）完成对工艺的改造，提高纯化回收率，至少提高收率30%以上；力争达到平均每个鸡胚产出1剂量疫苗。 （3）年产量达3000万支流感裂解疫苗。 （4）获得WHO的GMP预认证。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费320万元，要求申报单位自筹经费不低于320万元。 课题8、轮状病毒疫苗生产新工艺研究 1、研究内容 （1）解决轮状病毒口服活疫苗现有工艺中影响产品规模化生产的技术瓶颈，原代牛肾细胞有限传代培养技术。 （2）建立利用生物反应器进行轮状病毒疫苗生产的新工艺，采用生物反应器进行动物细胞大规模、高密度培养传代细胞，如Vero细胞等。 （3）多价轮状病毒纯化疫苗工艺技术。 （4）轮状病毒疫苗临床研究方法和判定标准的建立。 （5）研制新型轮状病毒疫苗,解决研制中三价轮状病毒基因重配株疫苗的问题、质量控制方法及质量标准的建立、临床研究评价体系的建立等一系列关键技术；建立各型轮状病毒基因检定方法，并进行标准化研究；建立检测混合成分中各型轮状病毒的方法，建立疫苗半成品、成品中各型病毒的检定方法，并纳入规程。 2、考核指标 （1）将原始代牛肾细胞传至次代牛肾细胞，解决现有产品规模生产能力的问题。 （2）建立利用生物反应器进行轮状病毒疫苗生产的新工艺，大幅度提高轮状病毒疫苗的产业化规模。优化工艺，使培养得到的的细胞培养物达到100～300L/批，培养细胞密度≥5×106cells/ml。收获得到病毒液90～270L/批。 （3）建立快速、敏感、稳定的病毒中间品、成品含量测定方法。 （4）解决轮状病毒口服活疫苗现有工艺中影响产品规模化生产的技术瓶颈，通过对现有轮状病毒疫苗生产工艺的优化研究和扩大生产规模，提高疫苗产业化规模，提高产品产量和质量。使该产品的生产规模达到400万剂量/年。 （5）完成三价轮状病毒基因重配疫苗临床前研究，并获得临床研究批件；建立三价轮状病毒基因重配疫苗质量控制方法和质量标准；轮状病毒疫苗临床研究方法和判定标准的建立。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费400万元，要求申报单位自筹经费不低于400万元。 课题9、水痘疫苗规模化生产和技术升级 1、研究内容 （1）二倍体细胞及病毒的规模化培养新技术，提高病毒滴度，提高单批次的病毒收获量。 （2）细胞培养过程中限制细胞代次研究，减少因细胞老化对OKa株病毒敏感性的降低。 （3）新的细胞破碎方法的研究, 提高疫苗的质量和增加疫苗单产。 （4）水痘疫苗新型稳定剂的研究，降低疫苗的生产成本。 （5）扩大适应症；开展将水痘减毒活疫苗用于成年和老年人带状疱疹预防的临床研究。 2、考核指标 （1）病毒滴度不低于5000PFU/ml。 （2）水痘疫苗的年生产能力增加到1000万人份。 3、经费预算 本课题拟安排国拨经费320万元，要求申报单位自筹经费不低于320万元。