寡肽的吸收机制及其生理作用(饲料研究)2000年第6期王进波 刘建新 浙江大学华家池校区动物科学院 摘要 蛋白质在动物消化道内经过各种消化酶的作用，降解成为游离氨基酸和寡肽。自20世纪60年代起人们逐渐认识到除了游离氨基酸，寡肽尤其是小肽也能够被动物直接吸收利用。目前关于寡肽的吸收机制有很多种观点，但大多数的研究认为，其吸收转运需要载体，而这些载体是具有生理活性的蛋白质，编码这些载体蛋白质的基因已被克隆；影响寡肽吸收转运的因素主要有寡肽分子的大小与氨基酸顺序、载体的特征、动物所处的生理状态以及日粮的营养水平等；寡肽除了对动物的营养作用外，某些具有生理活性的寡肽直接被动物吸收利用后，还可作为神经递质发挥生理活性作用，也有的在机体免疫调节中发挥重要作用。 动物对蛋白质的需要一直是动物营养研究的热点之一。过去人们认为，动物采食的日粮蛋白质在消化道内蛋白酶和肽酶的作用下降解为寡肽片段和游离氨基酸，而只有游离氨基酸才能被动物直接吸收利用，寡肽则只有再降解成游离氨基酸才能被利用。然而后来的一些试验发现，使用氨基酸纯合日粮或低蛋白平衡氨基酸日粮，动物并不能达到最佳生产性能。因而有些学者提出了完整蛋白质或其降解产生的寡肽能被动物直接吸收的观点，肽营养的研究也受到了广泛的重视。近年来人们对寡肽，尤其是小肽在动物体内的吸收机制、载体特性、生理作用的研究取得了很大进展。 1 寡肽的吸收机制 由于动物体内存在大量的肽酶，长期以来犬们大都认为，蛋白质降解产生的寡肽只有再降解为游离氨基酸才能被动物吸收利用。尽管有人推测，肽可以被动物直接吸收利用，但缺乏直接证据。直到 Newey和Smith(1960)首先提出了令人信服的寡肽可以被完整吸收的论据，人们才逐步接受了这一观点。此后人们就对寡肽在动物体内的转运机制进行了大量的研究，这些研究表明：动物体内可能存在多种寡肽的转运体系。寡肽在不同种动物体内的转运方式可能不同，同种动物也可能有集中不同的寡肽转运方式。 1.1 单胃动物小肽的吸收机制 日粮蛋白质在动物消化道内经过一系列酶的作用，最终降解成为游离氨基酸(FAA)和寡肽(OP)，其中的寡肽在小肠绒毛膜刷状缘受到氨肽酶A和氨肽酶N的作用，最终以游离氨基酸(FAA)和小肽(SP)的形式，被动物吸收利用。关于小肽的转运机制，目前还不十分清楚，可能有以下三种：①具有pH依赖性的H+／Na+交换转运体系，不消耗 ATP。Daniel等(1994)研究发现，小肽转运的动力来源于质子的电化学梯度；质子向细胞内转运产生的动力驱使小肽向细胞内运动。这样小肽就以易化扩散的形式进入细胞，引起细胞浆的pH值下降：从而活化Na+／H+通道，H+被释出细胞，细胞内的pH恢复到原来水平。②依赖氢离子或钙离子浓度的主动转运过程，需要消耗ATP。③谷胱甘肽(GSH)转运系统。Vincerzini(1989)报道，GSH的跨膜转运与Na+、K+、Cu+、Ca2+、Mn2+的浓度梯度有关，而与H+的浓度无关。 1.2小肽转运载体的特性 尽管目前对单胃动物小肽转运机制还不十分清楚，但小肽的转运需要载体是得到人们公认的。通过对小肽载体结构和功能的研究，进一步揭示其与小肽及各种相关离子的关系，是目前小肽转运机制研究的热点。某些哺乳动物的小肽载体基因已被克隆表达。Fei等(1994)利用从兔小肠中提取的mRNA反转录获得cDNA，然后将这些cDNA注射到非洲爪蟾的卵母细胞中，这种cDNA在爪蟾的卵母细胞中编码一种由707个氨基酸残基组成的多肽载体(PepTl)。pepTl有12个跨膜区，还包括一个很大的亲水环，这一亲水环伸出细胞外。通过严格的 Northern杂交发现，PepTlmRNA可在小肠内大量表达，肾脏和肝脏的表达水平较低，而在脑中则只能微弱表达。这主要是由于小肠是小肽的主要吸收场所；肾脏则能够吸收未被机体充分利用而对动物仍然十分有用的那部分小肽；肝脏细胞中的PepTl则能够吸收来自循环系统的肽类激素和药物；脑内的 PepTl棚则能够清除降解的神经肽。PepTl能转运2-5肽，但以二肽的转运速度最快，五肽以上的肽段则不能被转运。用微电极测定Gly-Sar转运前后细胞内的pH，结果发现，pH由7.22降低到7.0，这说明， PepTl对Gly-Sar的跨膜转运是与H+的跨膜转运一起进行的。因而改变环境的pH，就会影响Gly-Sar的转运。试验证明，爪蟾卵母细胞的PepTl转运速率在pH5.5时最大，其转运速率与pH的关系见图1；而改变Na+、K+、Cl-等的浓度并不影响其转运速率，这说明，G1v-Sar的跨膜转运与这些离子无关。pepTl对底物有广泛的适应性，不论小肽含有酸性、碱性或是疏水性氨基酸，PepTl都会将其跨膜转运进入细胞。因此，任何小肽都可以作为pepTl的底物，但就二肽而言，其亲和力就有很大不同(见图2) PepTl对含有较大脂肪族侧链的小肽的转运能力较强。由图2可以看出，其对酸性二肽Ala-Asp的转运能力最强，这可能证明β-羧基Asp的跨膜转运是以质子化的形式进行的。 Dantzig等(1994)发现了哺乳动物的hpt-l基因编码的蛋白质HPT-1是小肽转运的重要载体。HPT-1由3345个碱基对构成，其中包括一个2496个碱基的开放阅读框(ORF)，编码一种由832个氨基酸组成的蛋白质(HPT-1)。HPT-1的分子量为92KD，包括两个疏水区(一个在氨基端，一个在羧基端)：HPT-1的胞外区含LDRE和DXNDN各三个重复。HPT-1对小肽的转运也是依赖于质子梯度进行的，试验证明，pH7.5时其转运速度显著降低。 1.3反刍动物的吸收机制 与单胃动物不同，反刍动物对小肽的吸收可分为肠系膜系统和非肠系膜系统(Webb，1993)。又空肠、结肠、回肠、盲肠吸收的小肽进入肠系膜系统，而由瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠吸收的小肽则进入非肠系膜系统。由两系统吸收的小肽的数量见表1。 由表1可以看出，反刍动物的非肠系膜系统吸收的小肽的数量远远大于肠系膜系统，即非肠系膜系统是小肽吸收的主要途径。反刍动物对小肽的吸收，有的是以被动扩散的形式进行的；有的则是由载体介导的主动转运过程。M．Q．McCollum and K． E．Webb(1998)研究了羊瓣胃的Gly-Sar吸收机制，结果表明，其转运也是由载体介导，依赖H+的浓度梯度进行的。也有研究表明：在相同条件下，瓣胃上皮细胞吸小肽的能力要强于瘤胃上皮细胞。表1 反刍动物的小肽吸收 动物 肠系膜系统（g/d） 非肠系膜系统（g/d） 羊 52.01 308.40 牛 49.48 427.74 2影响寡肽释放、吸收的因素 2.1在消化过程中，寡肽(OP)的形成数量和比例与饲粮蛋白质品质有关 Savoie等(1987)对19种动物、植物性(豆科、谷物)蛋白进行体外消化试验，在胃蛋白酶-胰蛋白酶作用下，动物性蛋白质释出的肽与游离氨基酸的比例高，豆科蛋白次之，而谷物蛋白质的释放量最低。乐国伟等(1996)对几种不同动、植物性蛋白质饲料胃蛋白酶-胰蛋白酶水解产物的反相液相色谱分析表明，寡肽的释放量由大到小的依次为酪蛋白、鱼粉、蚕蛹、豆粕、豆饼、菜籽饼、玉米蛋白粉，饲料蛋白质的寡肽释放量与有效赖氨酸(Alys)呈正相关。刘选珍等(1996)的试验也表明：饲料寡肽释放量与碱性氨基酸含量相关的蛋白质的含量呈正相关。这可能是由于碱性赖氨酸、精氨酸等带正电荷，一般位于蛋白质分子的表面；且这些氨基酸残基暴露在外，易受酶的作用而降解。由这些试验可以看出，必需氨基酸含量高且平衡的优质蛋白在消化过程中容易水解生成分子量低而数量多的寡肽，而必需氨基酸缺乏、不平衡的饲料蛋白质则产生数量少、分子量大的肽(Meister，1987)。Chen，G．等(1987)对奶牛的试验则表明，当饲喂溶解性好的鱼粉或经过挤喷处理的豆粕时，其瘤胃寡肽的吸收率较未经处理的豆粕低。这可能是反刍动物的消化道内环境及吸收机制与单胃动物不同的缘故。 2.2加工、贮藏条件是影响蛋白质消化过程中寡肽释放量的重要因素 Restani等(1992)在体外水解试验中发现，蒸制加工后的肉品的SP释放量少；而冷冻干燥或鲜肉则释放较多的小肽。Swaisgood和Catignami(1991)则指出，经过加热长期存放的豆粕，肽的释放量仅为有效赖氨酸含量高的新鲜豆粕的63％。这可能是由于赖氨酸的侧链-NH2因易发生美拉德反应可使赖氨酸残基及其毗邻的氨基酸肽键难以断裂，从而影响蛋白质的消化率。加工、贮藏对蛋白质消化率与肽释放量、肽分子大小之间的关系研究尚少，因此其机理尚不清楚。 2.3 日粮营养水平影响寡肽的释放 Webb等(1992)报道，长期对大鼠限饲，肠组织吸收L-Met和L-Met-L-Met的能力上升。对人体的研究发现，当限制饮食时肠道肽酶的活性下降，寡肽的释放量下降。而当供给蛋白量充足的饮食时，肽酶的活性则会升高，从而小肽的释放量增加。 Chen，G．等(1987)报道，黑白花奶牛曰粮豆粕含量为14.5％，17.1％，20.6％时，其瘤胃吸收肽的量分别为22，33，34 g／d，这说明奶牛对寡肽的吸收与其日粮的蛋白质水平有关。 2.4肽链的长度对寡肽的吸收有较大影响 随着氨基酸含量的增加，小肽的吸收速率会显著下降。目前的研究认为，二、三肽能被完整的吸收，而大于三肽的寡肽能否被完整吸收还存在争议。 Grimble和Silk(1989)的报道指出，摄入肠道太皆兰肽以上的寡肽，在肠道内胰蛋白酶、肽酶的作用万进一步水解为二、三肽，才能被动物吸收利用，这就降低了这些寡肽的吸收速度。但也有的研究发现四肽、五肽甚至六肽都能被动物吸收。 2.5动物所处生理状态的影响 动物所处的生理状态和代谢变化也会影响小肽的吸收。泌乳牛和绵羊在注射牛生长激素(bST)后，肌肉和乳房组织对肽的利用加强，这可能是bST加大了机体对与代谢变化有关的氨基酸需要的缘故。另外，动物在不同的生理阶段，其利用寡肽的能力也不相同。动物的年龄、健康状况、生产阶段等都会影响其对小肽的吸收利用。 2.6氨基酸残基构型与载体对小肽吸收的影响 氨基酸残基的构型是小肽转运的决定因素之一。当赖氨酸位于N端与组氨酸构成二肽时，要比它位于C端时吸收速度快，而当它在C端与谷氨酸构成二肽时，其吸收速度更为迅速。小肽载体也对其吸收有一定影响，它对疏水性、侧链体积大的底物，如含支链氨基酸、蛋氨酸或苯丙氨酸的肽，具有较高的亲和力，而对亲水性、带电荷的小肽亲和力较小。 3 寡肽对动物的营养作用 3.1促进氨基酸的吸收，提高蛋白质的沉积率 小肽吸收系统在氨基酸的吸收中有很重要的作用，小肽转运系统具有速度快、耗能低、不易饱和等特点。很多试验证明，小肽的氨基酸残基比相应的游离氨基酸吸收更快。Hara等(1988)的试验证明，大鼠对白蛋白酶解产物的吸收强度高于相应游离氨基酸70％～80％。Rerat等(1988)在猪的试验中观察到，当十二指肠灌注肽的混合物时，除蛋氨酸外，出现在门静脉的氨基酸都比灌注相应的氨基酸混合物高，而且吸收峰高，表明肽混合物的吸收率高。大量研究表明：小肽与游离氨基酸在动物体内具有相互独立的吸收机制，二者互不干扰，这就有助于减轻由于游离氨基酸相互竞争共同吸收位点而产生的吸收抑制，进而影响动物体内蛋白质代谢。 日粮的氨基酸供给形式影响着动物体蛋白质的沉积。当以小肽形式作为氮源时，整体蛋白沉积高于相应的氨基酸日粮或完整蛋白日粮。乐国伟(1996)观察到灌注酪蛋白-SP时，雏鸡组织蛋白合成率显著的高于灌注相应的游离氨基酸混合物组。 Funabiki(1990)也观察到肽日粮组小鼠体蛋白合成率较相应氨基酸日粮组高26％。Rerat等(1988)报道，向猪十二指肠灌注寡肽后，血浆胰岛素的浓度高于灌注游离氨基酸组；而胰岛素的生理功能之一是参与蛋白质合成中肽链的延伸，增加蛋白质的合成。 Stehle等(1989)报道，当以肽的形式肠外供给病人谷氨酸时，能部分降低负氮平衡，防止肌肉氨基酸的损失，而游离氨基酸的形式则否。 3.2提高动物的生产性能 寡肽能够提高动物的生产性能，其原因可能与肽链的结构及氨基酸残基序列有关，某些寡肽在消化酶的作用下降解产生具有特殊生理活性的小肽，能够直接被动物吸收，参与机体生理活动和代谢调节，从而提高其生产性能。生长猪的日粮中添加少量小肽后，其生长速度加快，蛋白质效率和饲料利用率提高。施用晖等(1996)在蛋鸡基础日粮中添加小肽制品后，蛋鸡的产蛋率、饲料转化率显著提高。 Pocius，P．A．等(1981)报道，黑白花奶牛吸收的谷胱甘肽在乳腺GTPase的作用下降解为Gly，Cys，可作为乳蛋白合成的原料，促进乳蛋白合成。 Zambonino Infante等(1997)报道，用小肽代替部分海鲈鱼苗日粮中的蛋白质后，鱼苗的生长速度和存活率提高；胰凝乳酶和Y一谷氨酰转肽酶的活性提高，氨肽酶的活性降低；小肠消化功能的发育提前。 3.3促进矿物元素的吸收利用 许多研究都证实，酪蛋白水解产物中，有一类含有可与Ca2+、Fe2+结合的磷酸化丝氨酸残基，能够提高它们的溶解性。施用晖等(1996)报道，在蛋鸡日粮中添加小肽制品后，血浆中的Fe2+、Zn2+的含量显著高于对照组，蛋壳强度提高。Maria等(1995)报道，肉类水解中的肽类能使亚铁离子可溶性、吸收率提高。Fouad(1974)指出，位于五元或六元环络合物中心的金属元素可以通过小肠绒毛刷状缘，以小肽的形式被吸收。研究发现，铁能够以小肽铁的形式到达特定的靶组织，能自由地通过成熟的胎盘，而硫酸亚铁的铁进入血液是经主动转运途径被结合于运铁蛋白而吸收的，由于其分子量相当大(86KD)，被胎盘滤出，这可能是小肽铁生物学效价较高的原因。饲养试验表明：母猪被饲喂小肽铁后，母猪奶和仔猪血液中有较高的铁含量，而有机铁却无能为力，这表明，小肽对铁的吸收转运具有十分重要的作用。李永富等(2000)报道，对1～21日龄的乳猪分别添加小肽铁、右旋糖苷铁，然后分别测定其血红蛋白和血清铁蛋白的含量，结果见表2，图3。 Zambonino Infante等(1997)报道，在鲈鱼苗日粮中添加小肽后，能极大减少骨骼的畸形现象。这可能是由于有些小肽具有与金属结合的特性，从而促进钙、铁、铜和锌的被动转运过程及在体内的储存。 表2乳猪不同日龄的血红蛋白(Hb)：g／L 5日龄 10日龄 14日龄 20日龄 小肽铁 106.31 93.40 111.97 112.00 右旋糖苷铁 95.00 96.36 120.20 114.25 不补铁 88.11 70.25 72.20 66.79 4寡肽的其他生理活性作用 近年来，对蛋白质在消化过程中生成的肽的作用有了大量的研究，这些研究表明：这些肽不仅能够为动物提供氨基酸，而且很多还具有生理活性。作为生理调节物，它们可直接作为神经递质或间接刺激肠道受体激素或酶的分泌而发挥生理作用。在蛋白质活性作用的研究中，对乳中蛋白的研究最为深入。目前以从不同乳中蛋白的降解产物中分离出多种具有活性的肽，它们可能有参与神经组织调节、机体的免疫调节等功能；从鸡蛋蛋白中提取的肽能够促进细胞的生长和DNA的合成。 肽类是神经系统的重要活性物质，这些肽类很多是寡肽。很多研究证明，许多很普通的蛋白质在消化酶的作用下，可以分解产生活性肽。Zioudrou等(1979)，Brantl等(1979)研究发现，β-酪蛋白在胃肠道消化酶的作用下，降解产生含有7～10个氨基酸残基的酪啡肽，这种肽的氨基酸排列顺序与内源的阿片肽的N一末端序列相似。Brantl(1985)纯化出的六肽Tyr-pro-Phe- pro -G1y-Pro-11e，也具有阿片肽的活性。以后研究证实，Tyr-Dro-Phe-Pro-在体外也具有活性作用。不仅酪蛋白，而且小麦谷蛋白的酶解产物也分离出了具有与阿片肽的氨基酸序列相似的肽片段。研究表明：释放出的这些生物活性肽，可以完整地被吸收进入循环系统，作为神经递质而发挥生理作用。日粮蛋白质降解产生的肽在机体的免疫调节中发挥着重要作用。很多试验证实，一些蛋白质水解产生的胰影响着动物的体液免疫和细胞免疫。Jo11e镦198b1982)报道，β-酪蛋白产生的三肽和六肽可以促进体外腹膜内巨噬细胞的吞噬作用。 5结语 动物对蛋白质的利用中，小肽吸收机制的起着很重要的作用。这种机制使得氨基酸的吸收比降解为游离氨基酸再吸收更快，从而提高了动物对蛋白质的利用率。不仅如此，有些寡肽还可以作为生理活性物质，直接被动物吸收，参与动物生理功能和代谢调节。因此，小肽吸收对动物有着十分重要的意义。但目前为止，人们对小肽的吸收、转运、代谢机理和生理意义还不十分清楚，尚需更多、更深入的研究。