摘　要：乳铁多肽(乳铁素)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶水解，产生的具有特殊生理功能的活性多肽。乳铁素不仅保持乳铁蛋白的活性，而且活性要比乳铁蛋白更强。乳铁素具有抑菌、杀菌、抗癌、抗病毒、免疫调节等多种乳铁蛋白所具有的活性。乳铁素的抗菌活性很强，但其抗病毒活性相对较弱。文章讨论了乳铁素成员中活性较强的牛乳铁素和人乳铁素，内容涵盖了目前乳铁素研究的重点领域，讨论了乳铁素的作用范围及其作用机制，探讨了乳铁素结构与活性之间的联系。 关键词：乳铁蛋白；乳铁素；生物学活性 乳铁素(lacloferricin)是一种阳离子活性多肽，系乳铁蛋白的酶解产物。乳铁蛋白(lactoferrin，LF)属转铁蛋白家族，是分子质量为75 ku～80 ku的铁结合糖蛋白。除狗和兔以外的哺乳动物的分泌液中均可发现，如乳汁、泪液、唾液、黏液和精液等。中性粒细胞的颗粒中也有乳铁蛋白的存在[1]。乳铁蛋白在宿主防御反应中扮演了重要的角色。在乳铁蛋白的结构中，除了独一无二的带强正电荷的N末端外，其余结构与转铁蛋白家族的其他成员毫无两样。当乳铁蛋白在酸性条件下经胃蛋白酶水解后得到的多肽，不仅保持了许多完整蛋白的活性，而且甚至比母蛋白更有效[2]。这种多肽被称为乳铁素，因为其参与广泛的宿主防御反应，所以最近几年受到了广泛的关注。文中将讨论乳铁素的结构及其抗微生物(抗菌、抗真菌、抗病毒)活性、抗寄生虫活性、抗肿瘤活性及免疫调节机制。 1　乳铁素的结构 目前研究最多的是牛乳铁素(bovine lactoferricin， LfcinB)和人乳铁素(human lactoferricin， LfcinH)。虽然牛乳铁素和人乳铁素都是带正电的多肽片断，但肽片断的长度和氨基酸序列却不同。牛乳铁素的一级结构是由25个氨基酸残基组成的肽片断，其中的一部分氨基酸通过分子内的二硫键形成一个环状结构。然而，对人乳铁素的结构及确切的氨基酸序列仍有争议。最近的光谱法测定人乳铁素的一级结构同牛乳铁素的一级结构一样，包含了由1个分子内二硫键形成的环，其总体结构的长度大约是牛乳铁素的两倍 [3-4]。牛乳铁素在乳铁蛋白分子中的空间构象呈α-螺旋结构，当解离下来后α-螺旋结构消失，转变为扭曲的反向平行的以β-折叠为主的两亲性空间构象，其中几乎所有的亲水性基团排在牛乳铁素β-折叠的一侧，而另一侧聚集了大部分疏水性基团[3]。 核磁共振光谱法(nuclear magentic resonance spectroscopy)研究表明，牛乳铁素和人乳铁素的三维结构不同。游离的牛乳铁素采用了可溶性构象，在低渗盐溶液中牛乳铁素丢失了其在母蛋白中的α-螺旋，形成了一个扭曲的β-折叠结构，正是通过这种改变，游离的牛乳铁素形成了显著的两性结构，一端是几乎所有的疏水基团，而另一端是带正电荷的残基[5]。相反，在拟膜溶液中，人乳铁素虽然也可形成两性结构，但人乳铁素仍然有部分保持着α-螺旋，这部分螺旋甚至被保护起来。通过对大部分的抗微生物肽的二级结构研究表明，β-折叠结构的肽要比α-螺旋结构的肽容易穿透细胞膜[6]，而且含β-折叠的抗微生物肽的抗病毒活性要比含α-螺旋的肽抗病毒活性高[7]，这可能解释了牛乳铁素的活性为什么会比人乳铁素强。在生物界中，多种不同的抗微生物肽被发现，虽然这些肽之间没有同源性，但大多数的肽都含有大量的疏水氨基酸残基和阳离子氨基酸残基，他们通过不对称聚集形成了这种两性结构。 2　乳铁素的生物学活性 2.1　抗菌活性 牛乳铁素和人乳铁素都有广谱的抗菌活性[8]。由于乳铁素是一种阳离子多肽，人们认为乳铁素是通过阳离子残基末端与革兰氏阳性菌的磷壁酸和革兰氏阴性菌的脂多糖相结合，从而产生作用。在脂多糖存在的情况下，肽片断可以一种有序的方式自我联合形成一种排列顺序[9]，这种排列能够形成疏水和亲水表面。当这种排列的阳离子和细菌外膜的阴离子相互作用时，膜的流动性可能被阻断。通过这种作用，肽进入细胞并与胞内的靶位点发生作用。在乳铁素的杀菌效果试验中观察到的滞后时间以及用肽处理细菌细胞膜表面产生的气泡，可以说明这种机制(气泡是由于细胞外膜为了适应肽的插入膨胀而产生的)[10]。在研究中发现，乳铁素可以诱导细胞膜产生类似于微团的结构并形成空腔，造成细胞膜通透性改变，使小分子物质可以通过，并使跨膜电荷梯度和pH梯度改变[11-12]。因为乳铁素进入细菌细胞后存在于细胞浆中，所以乳铁素可能在细胞内发挥作用。由于乳铁素的这种渗透性可以穿透核膜，故有人指出，核苷酸可能是乳铁素在细胞内潜在的靶位点之一[6]。另外的研究报道称，细胞浆内包含了许多多聚阴离子，故这也可能是乳铁素与之相互作用的位点之一。现在有人试图通过乳铁素与细菌细胞膜的关系来阐明这种作用的分子机理，由于乳铁素的阳性残基与细胞膜的阴性基团相互作用，所以起始的静电作用是很重要的。肽的静电荷至少是＋4才能有最佳的抑菌活性[13]。再者，乳铁素的抑菌活性与这两端的氨基酸残基是密不可分的。乳铁素的阳离子末端含有大量精氨酸，精氨酸能通过静电作用和多重氢键与细胞表面的负电荷作用，因此人们认为精氨酸是乳铁素寻靶作用的有效氨基酸[3]。当阳离子端将肽与细胞连接，疏水端将立即与细胞膜的亲脂蛋白相互作用嵌入膜表面而使膜磷脂失去稳定性。对于疏水残基端的连接作用来说，色氨酸是很重要的，牛乳铁素疏水末端的色氨酸含量比其他乳铁素含量高，这也解释了牛乳铁素的抗菌活性比其他乳铁素活性强的原因[14]；如果当该末端第6位或第8位的色氨酸被丙氨酸取代，则抗菌肽将会失去任何抑菌活性；有人用芳香族氨基酸替换乳铁素中的色氨酸，结果使乳铁素的活性增强，说明可以选择适当数量和适当的色氨酸类似物来替代色氨酸，以改变对细菌的选择性，但当加入过量的芳香族氨基酸或疏水基团时，会导致对细菌选择性的丢失以及产生溶血现象[15]。 2.2　抗肿瘤活性 肿瘤的发生是一个很复杂的过程，涉及到许多因素。有研究表明，在不影响正常成纤维细胞和红细胞的浓度下，乳铁素和乳铁蛋白表现出对许多细胞系的抗肿瘤活性，如纤维瘤细胞、黑色素瘤和结肠癌等。与正常细胞相比，癌细胞成分有较大变化，其中一些种类的癌细胞质膜上的脂质首基成分变成了带负电荷的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine， PS)，乳铁素通过其阳离子末端与癌细胞发生结合[16]。人们认为，乳铁素一旦连接到肿瘤细胞，就会断裂细胞膜并激活Ca2＋/Mg2＋核酸内切酶和氧化剂依赖性细胞凋亡途径。虽然乳铁素导致癌细胞编程性死亡的确切机制还不清楚，但研究发现，对乳铁素这种阳离子肽来说，最大抗肿瘤活性所需的净电荷为＋7，比抗菌活性时要求的正电荷高许多[17-18]。 2.3　抗真菌及抗寄生虫活性 试验证明，动物口服乳铁素能够减缓真菌感染的症状，有效降低病原菌的致死效应，提高动物对寄生虫的抵抗能力，降低感染动物体内原虫的数量[16]。研究表明，乳铁素的抗真菌机制有两种。第一种是对真菌的直接杀灭作用。牛乳铁素和人乳铁素都可以和原生质膜发生作用，都表现出了对真菌细胞质的影响。通过乳铁素处理过的白色念珠菌孢生芽子可导致ATP从线粒体中合成和释放，被释放的ATP可以和原生质膜外的ATP靶位点结合，形成孔道，造成细胞死亡[19]。乳铁素的第二种抗真菌机制是参与宿主防御反应的正向调节。乳铁素可正向调控多形核(polymorphorus nuclear，PMN)白细胞对念珠菌属的杀菌作用，并且可增加有活性的分裂素蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)和蛋白激酶C的感应性，正向调节诱生型一氧化氮激酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)的表达并产生一氧化氮，促进乳铁蛋白和防御素的生成[20]。 乳铁素同样也具有抗寄生虫的活性。试验发现，小鼠的胚胎细胞与经乳铁素处理过的弓形虫的孢子细胞共同培养，细胞的存活率明显提高[16]。由于带正电的乳铁素可以和弓形虫细胞表面带负电荷的裂殖体相互作用，所以可能致使弓形虫细胞膜破裂，但也可能是乳铁素与弓形虫相互作用使弓形虫细胞释放出另外的一些物质，从而引起宿主防御反应。虽然乳铁素对寄生虫有一定的杀伤作用，但其作用机制还不太清楚。 2.4　抗病毒活性 乳铁素有抗病毒活性，但其活性较小。完整的乳铁蛋白的抗病毒活性要比乳铁素高7倍。由于乳铁蛋白对硫酸肝素和氨基葡聚糖有较强的亲和力，故乳铁蛋白通过连接这些分子可以阻止病毒进入细胞[21-22]。有证据显示，或是乳铁素和乳铁蛋白对病毒的作用机制是不同的[23]，也许乳铁素直接钝化病毒颗粒；或是乳铁素和乳铁蛋白抗病毒的作用机理一样，在病毒粒子内通过与核酸结合并正向调节宿主细胞对病毒进攻的防御。 2.5　免疫调节及协同作用 细菌死亡后会发生崩解，这时许多小分子物质被释放(例如脂多糖等)，这些小分子可导致免疫系统产生炎性应答。乳铁素另外的作用是作为免疫调节的媒介所表现出的抗炎症作用。由于牛乳铁素和人乳铁素都对内毒素有亲和作用，并且牛乳铁素可以和寡核苷酸黏合，通过黏合与中和这些分子，乳铁素阻止了单核细胞的激活和细胞因子的分泌，例如可以阻止引起炎症和脓毒败血症性休克的白细胞介素和α-肿瘤坏死因子[24-25]。乳铁素也可以通过抑制经典的补体激活途径来抑制炎性反应的产生，有研究报道，乳铁素是通过抑制经典补体激活途径中的C3转化酶来实现的[26]。牛乳铁素和抗生素、抗真菌剂以及抗病毒药物合用时充当了一个有效的协同媒介物，例如乳铁素与阿昔洛维(一种核苷类似物，用于抑制病毒复制)合用时可以抑制人合胞体病毒进入细胞，提高了这种药物的治疗效果；牛乳铁素与甲硝唑合用治疗阿米巴原虫可以取得很好的治疗效果，而且很大程度上降低了甲硝唑的用量，这样可以减少因服用甲硝唑带来的副作用[27]。人们认为，这种协同作用是因为乳铁素有扰乱膜的正常生理功能的特性，乳铁素的这种特性导致了细菌细胞壁渗透作用的增加，而且导致了膜电动势的消失，最终造成细菌ATP依赖性传递耐药排出系统活性的降低[28]。乳铁素的协同作用降低了抗生素的用量，这对于减少抗生素耐药菌株的出现提供了新的应用前景[29-32]。 3　小结 乳铁素作为一种阳离子抗菌肽有着独特的作用机理。它的广谱抗微生物作用使其成为抗菌肽中新的一族。乳铁素的特殊结构是其发挥生物学活性所必需的分子基础，许多研究都证实了含有β-折叠结构的肽要比含有α-螺旋结构的肽的生物学活性强，含有环形的肽要比线形的肽的活性强，由于乳铁素家族中的牛乳铁素具有许多抗菌肽中所包含的优势构象，故牛乳铁素可能会成为今后几年抗菌肽的研究热点。近年来人们通过对乳铁素的大量研究工作，对乳铁素的结构、功能的认识逐渐深入。虽然乳铁素不同活性的作用机制还没有完全搞清楚，但乳铁素分子量小、性能稳定以及其较强的抗菌活性和免疫调节功能，显示出其不可估量的应用前景。 参考文献（略） ＊收稿日期：2006-09-08 作者简介：冯晓声(1982－)，男，吉林长春人，硕士研究生，主要从事动物内科学及奶牛乳腺炎的防治研究。