近年来，水稻与病原物互作的分子生物学机制受到广泛重视，在植物-病原物互作的识别、信号传导、防卫反应相关基因及其调控等方面取得不少进展。同时，水稻作为禾谷类作物功能基因组学和遗传转化研究的模式植物，其抗病分子生物学及遗传转化技术体系不断发展和成熟，并提出了一些新的水稻抗病基因工程策略，为通过基因工程来提高水稻抗病性奠定了基础。本文简要评述近年来水稻抗病基因工程的研究现状及其进展。 　　1 水稻抗病性分子生物学 　　1.1 水稻的R基因 　　水稻中已定位至少30个稻瘟病抗性位点(resistance loci)和25个白叶枯病抗性位点。其中抗稻瘟病 (Magnaporthe grisea)的Pib和Pi-ta和抗白叶枯病(Xanthomonas oryza pv. oryza，Xoo)的Xa21和Xa1基因已经被克隆鉴定。Xa21基因编码含 1025个氨基酸的蛋白，具有一个富含亮氨酸重复(leucine rich repeat，LRR)的胞外受体结构域、一个跨膜结构域和一个胞内丝-苏氨酸激酶结构域。该基因的发现首次将R基因的受体功能和下游信号传递功能联系在一起，即胞外LRR结构域感受病原菌信号后，活化胞内蛋白激酶，并激活下游信号，导致HR。Pi-ta基因编码的受体蛋白位于细胞质，N端含有核苷酸结合位点(nucleotide-binding site，NBS)，C端包括富含亮氨酸区域(leucine-rich domain，LRD)。与Pi-ta对应的稻瘟菌无毒基因AVR-Pita基因也被分离，该基因编码具有蛋白酶性质的多肽。瞬间表达Pi- ta和无毒基因AVR-Pita的水稻产生了HR并且激活抗病防卫反应基因的表达；酵母双杂交实验和far-Western analysis分析表明Pi-ta和AVR-Pita 发生了直接互作，而且Pi-ta的LRD区域可与AVR-Pita专化性地结合。这些实验结果证明Pi-ta和AVR-Pita的互作。 　　R基因介导的抗病性水平高，常表现高抗，是抗病基因工程中常用的抗源。但R基因和avr基因的互作表现为品种对小种的专化性抗性，所以植物抗病性常因病原菌群体生理小种的变化而被克服。稻瘟病和水稻白叶枯病都是“基因对基因”互作的病害体系，抗病品种抗性容易丧失。因此，利用R基因的抗病基因工程应着眼于创建非小种特异性(non-race specific)的抗性，以避免因R-avr基因的专化性互作造成抗性丧失。De Wit设想，将avr基因和R基因与病原菌侵染诱导表达的特异性启动子构成双组分系统转入植物，当病原物侵染时，引发过敏反应，表现抗病性。这为抗病基因工程提供了新的思路，但是目前还缺乏这种受病原菌侵染诱导的特异性启动子。随着最近对在水稻中可诱导表达的启动子及病原菌无毒基因的研究及分离克隆，这方面的研究将会有突破。利用R基因时还应充分评价和预测它的持久性。Vera Cruz等通过研究相应的无毒基因的侵袭力(aggressiveness)和生存适合度(fitness)成功地预测出水稻白叶枯抗病基因Xa7为一较为持久的抗病基因。 　　1.2 防卫反应基因和系统获得抗性 　　R基因和avr基因识别后，引发过敏反应，同时通过信号传导途径诱导一系列抗病防卫反应基因表达，产生系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)。植物产生SAR后，能在较长时间内保持对多种病原菌的增强抗性。抗病防卫反应中表达的基因主要是编码病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)和植保素合成相关酶基因。PR蛋白在植物抗病性和系统获得抗性中起重要作用，有些PR蛋白在体外就有抗菌活性。已经克隆并鉴定了水稻中的几类PR蛋白基因，其中包括能降解真菌细胞壁的PR-3(编码几丁质酶)和PR-2( 编码β-1,3-葡聚糖酶)，以及有抗菌作用的类奇甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLP，属PR-5类)等。通过转入自身或其它植物的防卫反应相关基因来提高水稻抗病性，已有大量的尝试。 　　植物系统获得抗病性的显著特点是产生广谱抗病性，这是因为SAR的产生是一系列防卫反应基因协同作用的结果。因此，通过调节SAR反应来获得广谱抗病性，是一条很有潜力的途径。NPR1是调节拟南芥中SAR信号传导途径的一个关键基因，与参与动物免疫反应的转录因子NF-κΒ羧基末端的锚蛋白重复单位结构域(ankyrin-repeat domain)有相似的功能域，组成型表达NPR1基因的拟南芥植株表现出对丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)和寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)的广谱抗性。最近，研究表明水稻中也存在类似NPR1 介导的信号传导途径，组成型表达NPR1基因的水稻植株对白叶枯病和稻瘟病表现抗性。模拟病斑突变体(lesion mimic mutant)通常能在无病原物存在的情况下产生系统性过敏性环死斑，并表现出对多种病原物抗性的提高。Yin等最近鉴定了一个水稻模拟病斑突变体spl11，spl11的纯合体对水稻白叶枯病菌的2号、3号和4号小种及9个不同的M.grisea分离物都表现出一定抗性，Northern分析还表明spl11中一些已知的防卫反应基因表达量相应提高。 　　2 水稻抗真菌病害基因工程 　　2.1 抗真菌蛋白基因工程 　　水稻稻瘟病和纹枯病(Rhizoctonia solani)是最严重的真菌性病害。稻瘟病菌生理小种多且容易变异，生产中的抗性品种一般3～5年就可能丧失抗性。纹枯病菌是典型的土壤寄生菌，寄主范围极广，至今尚未发现很好的抗性资源。抗病基因工程为解决这一问题开辟了新的途径，植物来源的抗真菌蛋白具有安全性和有效性等优点，现已成为主要利用的抗源基因。 　　M. grisea和R. solani的细胞壁含几丁质和葡聚糖等成分，它们能被几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶降解，常被作为抗病基因工程的靶体。Nishizawa等将水稻几丁质酶基因Cht-2和Cht-3分别转入粳稻Nippobare和Koshihikari，发现转基因植株中Cht-2的产物在细胞内积累，而Cht-3的在细胞外积累。转Cht-2或Cht-3基因植株的R0及R1代对稻瘟菌致病小种的抗性显著提高，而且与几丁质酶的表达量相关。Lin等和Datta等将从水稻中克隆的Ⅰ类几丁质酶基因Chi11转入籼稻获得转基因植株。与对照相比，转基因植株对R. solani表现出一定抗性，而且几丁质酶含量和活性与抗病性呈正相关；部分转基因植株几丁质酶含量或活性高达对照的14倍，对R. solani表现完全抗性。RC-7是从受R.solani侵染的水稻品种IR58中分离的一个几丁质酶基因，其氨基酸序列与已知的水稻其它几丁质酶显著不同。将RC-7基因转入IR72等品系后，转基因植株显著提高了对纹枯病菌的抗性。 　　几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶在离体条件下对真菌细胞壁的降解具有协同作用。Feng等将水稻碱性几丁质酶基因 RC24和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因β-1,3-Glu同时导入水稻，部分R1代转基因植株对广东省稻瘟菌5个代表菌株表现出不同程度的抗性提高。对获得的整合有RC24和β-1,3-Glu双基因的R1代纯系植株叶片离体接种R. solani，抗性明显提高。最近，Akiyama和 Pillai从水稻中分离了一个新的β-1,3-葡聚糖酶，该基因与GST的重组表达蛋白在体外能迅速降解稻瘟病菌的细胞壁，显示了良好的应用前景。 　　TLP在体外能抑制多种真菌的孢子萌发和菌丝生长。Datta等把水稻TLP基因(TLP-D34)导人籼稻品种IR72和 IR51500中，Western blot分析表明转基因植株中表达产生一个23 kD的TLP-D34蛋白，且对纹枯病的抗性明显提高。天花粉蛋白 (trichosanthin)是中药植物栝楼(Trichosanthes kirilowii)根部的一种可以使核糖体失活的植物蛋白，在体外对包括稻瘟菌在内的多种真菌有抗菌活性。转trichosanthin基因的水稻能明显延迟或降低稻瘟病发生，转基因稻的鲜重也高于对照，且该基因高水平表达对水稻没有伤害。但该基因在水稻中应用的安全性仍有待研究。puroindolines是小麦种子中的一种低分子量蛋白，在体外有抗菌活性。通常水稻不产生此物质，将编码该蛋白的基因pinA和/或pinB转入水稻后显著提高了对M. grisea和R. solani的抗性，症状分别减轻了29％～50％和11％～22％。从转基因水稻叶片中提取的puroindolines在体外能抑制M. grisea和R. solani的生长，抑制率达35％～50％。因puroindolines存在小麦种子中，是对人体安全的，所以在水稻中是完全可以应用的。水稻中其它类型的防卫反应基因也能提高抗病性。Rir1b是一水稻受非病原菌丁香假单胞菌 (P. syringae pv. syringae)诱导表达的防卫反应基因，编码一个11 kD的小肽，并分泌到胞外，组成型表达Rir1b的转基因水稻提高了对稻瘟菌的抗性。 　　2.2 基于植保素的抗病基因工程 　　植保素(phytoalexin)是植物受病原物侵染后产生的低分子量抗菌化合物，在植物抗病反应中起着重要的作用。植保素合成途径中一些相关合成酶基因已被克隆，这使得从分子水平上调节植保素合成来增强抗病性成为可能并初见成效。水稻中主要存在萜类和酚类植保素，植保素含量与水稻抗病性紧密相关，植保素含量高的品种其抗病性也高。植物的类黄酮(flavonoid)代谢途径合成酚类及多种抗菌化合物。该途径也存在于水稻，并已经分离到相关基因。花色素苷(anthocyanin)也是该途径的代谢产物，Gandikota等将来自玉米的参与花色素苷合成的两个调节基因C1(coloured-1)和R(red)及查尔酮合成酶基因C2(coloured-2)同时转入粳稻台北309，转基因植株R1 代提高了对稻瘟病的抗性。trans-reseratrol是植物体内普遍存在的一类植保素，1,2-二苯乙烯(stilbene)合成酶是其合成途径中的关键酶之一。将葡萄的该酶基因在其自身启动子驱动下转入水稻，提高了对稻瘟病的抗性和白叶枯病的抗性。这些结果表明通过导入多个与植保素合成相关基因来增强水稻抗病性是可行的。 　　3 水稻抗细菌病害基因工程 　　白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。研究发现，水稻中存在对Xoo多小种高度抗性的基因，包括已经克隆的 Xa21基因。Xa21基因由野生种长药野生稻(Oryzae longistaminata)引入，带有Xa21位点的品种能抗多数已知的Xoo小种。转Xa21基因的水稻植株对来自8个国家的29个株系都表现抗性，且转基因株和供体植株的抗性谱相同，表明单基因能控制多小种病害。我国科学家将Xa21基因转入生产中广泛推广的籼稻优良品种或不同的杂交系，用以生产抗白叶枯病的杂交稻。转基因后代能稳定遗传，在田间对Xoo表现出良好的抗性。最近，Xa21基因已转入我国杂交稻生产中广泛应用的恢复系明恢63。明恢63和不育系珍汕97A的杂交稻汕优63对Xoo小种表现出广普抗性，并且保持了汕优63的优良农艺性状。但是，Lee等发现在朝鲜有一些毒性小种能克服Xa21的抗性，因此在利用Xa21基因进行抗病基因工程时应充分考虑特定的生态区域。此外，Xa21基因介导的抗性受水稻发育阶段调控，从幼苗期的完全感病逐渐增强到成株期的完全抗病，如能发现其控制机制，就可以创建全生育期抗病的水稻。 　　单个R基因介导的抗病性只能抗有限的小种，仍面临抗性丧失的风险。传统的抗病育种和分子标记辅助选择已证明，在水稻中通过实现多个R基因聚合(pyramiding)，可扩大抗病谱，降低对病原菌小种的选择压力，延长抗病品种的使用寿命。Singh利用分子标记研究了基因聚合对白叶枯病的抗性。在自然条件下，水稻品系PR106带有Xa21、Xa13和Xa5基因的两个或3个组合都能扩大对Xoo的抗性谱。只带有Xa21的PR106对Xoo的PX04株系表现感病，但聚合了Xa21和Xal3及Xa5的PR106对PX04表现抗病，这充分说明多基因可以扩大抗病谱。因此，随着更多的水稻抗病基因的克隆，利用基因工程给水稻导人单个抗多小种的R基因或几个不同的R基因以通过多基因聚合来提高抗病性是可行的。 　　抗菌肽是植物及其它生物产生的一类小分子量肽，将编码抗菌肽的基因转入植物可以提高对细菌和真菌病害的抗性。杀菌肽(cecropin)是一类由昆虫产生的抗菌肽，具有抗革兰氏阴性菌活性，在低浓度下就能起作用。cecropin合成酶基因曾被转入烟草和马铃薯等多种作物，并对青枯病菌有一定的抗性。我国Huang等将cecropin合成酶基因转入水稻中百4号和京引119两个品系，部分转基因植株对细菌性条斑病(Xanthomonas oryza pv. oryzicola)和白叶枯病的抗性显著提高。Sharma等将家蚕的cecropin B基因与水稻几丁质酶基因的信号肽融合并构建组成型表达载体，使cecropin B基因产物能分泌到胞外而避免被植物细胞降解。转基因水稻植株接种白叶枯病菌后产生的病斑少而且病斑仅限制在侵染点周围。同时，抗性的高低与cecropin B基因的表达量正相关。而对照转基因植株(转cecropin基因没有融合信号肽)则表现感病。 　　AP1蛋白是甜椒(Capsicum annuum)中铁氧还蛋白(ferredoxin)的类似物，可以延迟丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. syringae)在非寄主植物上过敏反应的发生。AP1基因转入粳稻品种Eyi105后，转基因植株对白叶枯病菌6号小种的抗性提高，AP1 表达量越高，抗病性越强。AP1可能的作用机制是通过干扰细菌激发子harpinPss和植物中受体的互作而延迟过敏反应的发生。因此，转AP1基因介导的抗病机制有别于典型的转入抗病基因或抗菌蛋白基因。若通过该基因与抗病基因或抗菌蛋白基因的聚合，则可降低对病原菌的定向选择压力，延长抗病品种的使用寿命。这为植物抗病基因工程也提供了一条新的思路。 　　4 水稻抗病毒病害基因工程 　　水稻中已发现20多种病毒，造成严重损失。以病毒的外壳蛋白基因、复制酶和核酶等基因为目的基因的水稻转基因研究已经取得重要进展。 　　病毒外壳蛋白(coat protein，CP)基因被转入植物表达后，由于外壳蛋白的积累抑制了病毒侵染早期的脱衣壳过程，使病毒粒子无法暴露出内部核酸，进而阻止了病毒的复制和增殖。水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是水稻的重要病毒病。 Hayakawa等首先将RSV的CP基因转入粳稻，转基因植株中CP的含量达总可溶性蛋白的O.5％，病毒接种15 d后，症状比对照显著减轻。水稻东格鲁球状病毒(Rice tungro spherical virus, RTSV)和水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus，RTBV)是水稻重要的病毒病原。把RTSV的CP基因CP1、CP2和CP3单独或同时转入粳稻后，转基因植株R1、R2和R3代中，有17％～73％的植株显著延迟了病毒复制，但同时带有几个CP基因的植株其抗病性并没有表现出累加效应。 　　以编码病毒复制酶基因转化水稻也获得成功。Huet等将来自RTSV的复制酶基因分别以反义和正义序列转入水稻。结果表明，转入反义序列的水稻植株对RTSV表现中度抗性(60％)，而转入完整正义序列或其片段的水稻即使在很高的病毒接种量和转基因转录水平较低时都表现完全抗性，而且对来自不同地理区域的RTSV株系也表现抗性。抗RTSV的转基因植株也通过共抑制而对RBSV表现出一定的抗性。水稻黄斑驳病毒(Rice yellow mottle virus，RYMV)发生在非洲稻区，Pinto等将来自RYMV的RNA复制酶基因转入感病品种，转基因植株对来自不同生态区的RYMV株系都表现抗病。这两例试验中，转基因植株的抗病机制是给水稻转入病毒基因组来源的序列导致依赖于同源性的病毒基因沉默(homology-dependent gene silencing)并抑制病毒侵染。这种同源依赖的基因沉默抗病程度较高，只要侵染的病毒与转基因或基因片段具有同源性，就能通过共沉默而抑制病毒侵染，显示了该策略的应用潜力。另外，Han等将一个核酶基因(ribozyme)融合到一段能与水稻矮缩病毒(Rice dwarfvirus,RDV)5号片段杂交的序列后转入粳稻Tongling 1号，转基因植株表现高度抗病。 　　尽管抗病毒基因工程取得了不少进展，但对转入病毒来源基因序列可能引起生态风险值得注意。潜在的风险主要来自：(1)可能引起更严重的复合病害；(2)抗病转基因植株可能会选择出强毒株系；(3)转基因可能会逃逸至杂草；(4)转基因和其它入侵病毒可能发生重组而产生新病毒和病毒病。目前这些担忧尚无直接的实验证据。正在努力通过改进抗病毒基因工程策略来将风险降低到最小。 　　5 展望 　　近1O年的水稻抗病基因工程以转入单基因为主，取得了不少成果。由于抗病基因所介导的抗病性具有高度专化性，只针对一种病害的一个或几个小种，抗病谱比较窄；而导人防卫反应基因的转基因植株大多表现出部分抗性。因此，对多数转单基因的抗病水稻来说，抗病机制单一，抗多病害或多小种的能力低，一旦病原菌群体发生变化，抗病性就可能被克服。另外抗病转基因水稻具有一定的生态风险，如抗病毒病的转基因可能会和某种既存的RNA通过重组而产生新病毒和病毒病，转基因的抗病水稻群体的增大会加大对病原菌的选择压，病原菌突变加速进而导致致病性更强超级病菌的产生。目前大多抗病基因工程水稻尚未真正用于生产实践。 　　植物抗病基因工程的趋势是创建持久、广谱的抗病性。正如拟南芥SAR信号传导途径关键基因NPR1能介导广谱抗病性，分离和利用参与调节植物抗病信号传导途径的关键基因将有利于培育持久、广谱的植物抗病性。随着基因组测序的顺利完成，作为禾谷类作物功能基因组研究的模式植物，水稻抗病性的分子机制及其抗病信号传导途径将进一步阐明，并有望分离获得一些参与调节抗病信号传导途径的关键基因，这将极大地推动培育持久、广谱抗病性水稻品种的研究与实践。同时，水稻遗传转化技术体系的日趋成熟，有利于将几个不同作用机理的目的基因或能改变某一复杂抗病途径的相关基因联合进行转基因研究，可以抗多种病害并延长抗病性，这方面的工作已经有了良好的开端。