摘要：防御素是一类不超过100个氨基酸的阳离子活性肽。因其能有效地杀灭细菌、某些真菌、螺旋体和囊膜病毒等微生物，成为世界范围内的一个研究热点。其中，仅β-防御素存在于禽类。依据禽类β-防御素分子结构、来源与氨基酸组成，可将其分为不同的类别。禽防御素广泛分布于禽的血液和消化道、呼吸道、泌尿生殖道上皮细胞等部位。进化关系分析表明，其他哺乳动物与鸟类抗菌肽来自于共同的β-防御素远古基因。禽类防御素的生物学活性显示其具有潜在的经济意义。为此，就其分类与组织分布、进化、生物学活性、基因工程及应用进行综述。　　关键词：防御素；分布；进化；生物学活性　　近年来，在植物、被囊动物、昆虫、鱼、两栖动物、哺乳动物和鸟类中发现了具有抗菌作用的多肽，称之为抗菌肽——防御素(defensin)。防御素具有广谱抗微生物活性，是宿主抵抗外来致病性微生物侵袭的重要防线，也是所有物种先天性免疫系统的一部分，具有重要的潜在应用价值，有可能成为新一代抗菌药物。目前，已从动物、人类和植物体内分离纯化出100种以上的防御素。近年来，国内外对禽类防御素的研究报道也不断增多，下面对其研究进展做一概括与评述。　　1防御素的定义与分类　　防御素是一类古老的内源性抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPS)，富含半胱氨酸，带有3个β-片层结构，被一个β-发夹转角环连接起来，是阳离子两性肽。其主要的分子特征是6个半胱氨酸残基形成3对2硫键，成熟肽大约有38个～42个氨基酸，　　分子质量约为3ku～4ku。防御素具有广谱抗微生物作用，包括抗革兰氏阳性、阴性菌、原生动物(原虫)、一些真菌和具有囊膜的病毒，如人类艾滋病病毒[1]。防御素可分为3个亚类，分别为α-防御素、β-防御素和θ-防御素。α-防御素和β-防御素可形成二聚体，仅仅在形成二硫键的半胱氨酸连接的配对和氨基酸残基的长度上具有差异。而θ-防御素分离自猕猴白细胞，具有独特的环状结构，由两个类似于α-防御素样的9个氨基酸片段环化而成。　　2禽防御素的分类及其在组织中的分布　　根据其组成肽的同源性和基因结构，Zhang等将β-防御素分为3类。第1类β-防御素含有一短前体肽(长度为63个～64个氨基酸残基)和1个短的内含子(小于1.6kb)；第2类含有较长前体序列(68个～69个残基)和具有大于6.5kb的内含子；禽类防御素属于β-防御素中的第3类半胱氨酸二硫环类肽。　　依据其来源，禽防御素又分为鸟类异嗜白细胞肽和非异嗜白细胞肽。鸟类白细胞肽包括鸡白细胞肽CHP-1与CHP-2(chickenheterophilpeptides，CHP)、鸡的3种Gallinacins(Gal-1，-2和Gal-1a)、火鸡的3种白细胞肽THP-1，-2与-3(turkeyheterophilpeptide，THP)和来自鸵鸟的Ostricacin(ostrichpeptide，OSP-1)。　　根据同源性氨基酸残基，禽白细胞类β-防御素被分为两个亚类。第1亚类包括THP-1，CHP-1，CHP-2，Gal-1和Gal-1a，其22个氨基酸相同。第2亚类包括THP-2，Gal-2以及Osp-1，其17个氨基酸一样，同时，这些肽在第6个半胱氨酸之后有2个氨基酸残基的缺失。两个亚类防御素均具有相同的7个保守性氨基酸残基，3对半胱氨酸、1个甘氨酸和1个脯氨酸。非白细胞防御素具有鸡、火鸡上皮细胞和帝企鹅胃上皮细胞β-防御素的特征，如鸡的Gal-3与火鸡的Gallopavin-1(GPV-1)，都有39个氨基酸残基。而对新近报道的鸡Gal4～13没有进行详细的划分，有待进一步研究其类别[2]。　　所有禽类防御素具有与人类和牛防御素共同的保守区，包括3对半胱氨酸二硫键和1个甘氨酸残基[3]，这暗示其在进化上的意义。禽类防御素基因的分类，有助于了解其结构上的异同，为进一步揭示其在不同家禽(鸟类)的功能与作用奠定基础。　　禽类的β-防御素分布广泛，可在鸡、火鸡、鸵鸟的血液，鸡、火鸡的上皮细胞，企鹅的胃上皮细胞存在[3]。这与防御素基因在不同组织中的表达方式有关。防御素基因在动物体内的表达存在两种方式——固有型和诱导型表达[4]。两种表达方式均具有组织特异性。Gal-1存在于鸡的骨髓、肺脏、法氏囊和皮肤，Gal-3可在舌、法氏囊、气管、皮肤、食道、气囊、大肠和肾脏等组织器官广泛表达，Gal-2在肺、骨髓中表达[5]。在体外培养的法氏囊细胞、肺上皮细胞和气管上皮细胞中分别加入LPS和灭活的卡介苗，仅仅在气管上皮细胞中Gal-3基因表达量增加，为诱导性表达。而在肺上皮细胞、法氏囊上皮细胞中表达量没有变化，为固有性表达。Gal-1和Gal-2也为固有性表达。而体内研究表明，Gal-3在气管的表达显著地受嗜血杆菌的的诱导[3]，但在舌、法氏囊的表达则不受其影响，这表明Gal-3在维持这些部位正常的菌群起重要作用。后来证明，Gal-1和Gal-2在骨髓和肺脏中表达，Gal-3在骨髓、舌、气管、法氏囊表达。Gal-4～Gal-7在骨髓中表达，其中Gal-5也可以在舌、气管、肺、脑部较低水平的表达，而Gal-8～Gal-13在肝、肾、睾丸、卵巢以及生殖道内表达。据此将Gal-1～Gal-13分为两类，Gal-1～Gal-7主要在骨髓和呼吸道，而Gal-8～Gal-13局限于肝脏、泌尿生殖道[2]。而火鸡的GPV-1在其气管上皮组织表达。企鹅的Sphe-1与Sphe-2存在于其胃内，其浓度在食物贮存期比消化期明显地高，所以企鹅可以保持其胃内食物至少两周不变质，说明此两种防御素在胃内具有抗微生物作用。禽类防御素的组织表达方式是禽先天性免疫机制选择的结果，与其他动物一样，在抵抗外来微生物或者杀灭进入体内病原微生物的免疫防御中起重要作用[6-10]。因此，进一步研究禽类防御素的组织表达方式与调控机理，对于分析和阐明其在禽类免疫中的作用具有重要意义。　　3禽类防御素的生物学活性　　由于禽类异嗜性白细胞缺乏由超氧化物离子、过氧化氢和过氧化物酶组成的氧化机制，禽类则更多依赖非氧化机制(如溶菌酶、阳离子蛋白和肽)来抵抗外来微生物的侵袭与感染，维护机体健康。而β-防御素就是禽类先天性免疫的重要组成部分，不但在内源性免疫中起重要作用，为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障，在机体固有免疫防御中发挥着重要作用。β-防御素也具有广谱抗致病性微生物活性，其抗菌谱分别为[11]Gal-1和Gal-1a抗白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、产单核细胞李氏杆菌；Gal-2抗大肠埃希菌、产单核细胞李氏杆菌；CHP-1、CHP-2与THP-1抗白色念珠菌、大肠埃希菌、波氏菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、空肠弯曲杆菌、鸡毒支原体；THP-3抗白色念珠菌、沙门菌、空肠弯曲杆菌；OSP-2抗大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌；Sphe-2抗枯草芽孢杆菌、肠炎沙门菌、烟曲霉菌。　　另有报道，禽异嗜白细胞肽可抑制大肠埃希菌、白色葡萄球菌、白色假丝酵母、沙雷氏菌属的黏赛杆菌的生长。但仅有一些抗菌肽(如鸡、火鸡异嗜白细胞肽)具有抗白色念珠菌活性[3]。与禽类β-防御素相比，人工合成的企鹅抗菌肽Sphenicin-2的抗菌谱较广[12]，不仅具有杀菌活性，抗所有试验的革兰氏阳性菌(除腐生葡萄球菌外)，还具有抑制细菌活性，抑制试验表明可抑制所有革兰氏阴性菌(除E.coli1106与弧菌metsnikovii外)。Sphenicin-2也可抑制烟曲霉菌孢子的形成，但无抗假丝酵母活性。在低pH、企鹅胃内容物的条件下，人工合成的Sphe-2也保持抗微生物活性。显然，Sphenicins的抗菌特性是在孵化期维持雄性企鹅食物新鲜的重要机制。对于新发现的禽防御素Gal-3～Gal-13，需要进一步研究其抗微生物作用，为防御素的应用奠定基础。　　β-防御素杀灭微生物的机制仍未阐明。许多研究者认为，其作用是基于抗菌肽的两个主要特征，即阳离子性和两性分子性基础之上。原理是带负电的菌膜与β-防御素阳离子的相互静电作用使β-防御素与细菌胞膜黏合，接着在两个β-防御素单体的β-链氨基末端引起通道二聚体形成。二聚体形成的方式是肽的疏水区向着细菌内膜，而亲水区朝向每一个防御素单体，这导致跨膜电压变化，引起膜通透性的破坏，从而致使微生物死亡。　　4禽防御素的进化　　在进化上，除保守的3对半胱氨酸残基外，禽类β-防御素与其他脊椎动物(人、牛、猪和鼠)β-防御素的一级结构高度变异[3]。从平胸鸟——鸵鸟体内分离出的Osp-1表明β-防御素基因已存在很长时间。平胸类鸟是最古老鸟类的活化石，鸵鸟和哺乳动物的基因组仍保留有β-防御素基因，这暗示该防御素很可能来源于远古基因。鸡Gal-3和火鸡GPV-1与响尾蛇毒液中的一种肌肉毒肽(myotoxic)和雄性鸭嘴兽毒液肽比较，也发现其结构类似。这样两组化合物均具有β-防御素主要结构。对鸭嘴兽毒液研究表明，毒液中4个肽的3级结构与牛中性粒细胞β-防御素-1相似[13]。由于爬虫动物是最古老的脊椎动物种，这些证据表明，β-防御素基因起源于远古基因，并由远古基因演化而来。　　迄今，β-防御素的氨基酸序列和结构更类似于昆虫防御素而不是哺乳动物α-防御素，而且仅在两类古老动物(脊椎动物的爬虫类和鸟类动物)体内发现β-防御素和β-防御素样肽，这表明防御素家族起源于β-防御素。所有防御素的祖先是β-防御素样分子。在哺乳动物，演化的结果不仅出现了β-防御素，也产生了α-防御素和θ-防御素。θ-防御素可能是进化过程的进一步证据，因为在恒河猴白细胞内同时发现了θ-防御素和其他防御素。通过包含有仅仅3个半胱氨酸残基的两个防御素前体的修饰和连接形成该肽，其前体是带有未成熟终止密码子、变异的α-防御素基因的产物。基因进化关系表明，研究禽类防御素具有重要意义，至少可以从其基因组中查找更多的防御素基因，也暗示其在家禽抗病育种上的意义，但尚需进一步深入研究。　　5禽防御素的基因工程　　防御素天然产量低，合成或从机体中提取步骤复杂、产量低，价格相当昂贵，利用基因工程技术生产防御素具有现实意义。因此，从原核表达、真核微生物表达、动物细胞和转基因植物表达等方面对防御素进行研究成为热点。利用蛋白A做载体与人的防御素HNP-1和昆虫杀菌肽CECROPIN/melittin构建融合蛋白，在葡萄球菌和大肠埃希菌中得到表达，但表达产物HNP-1没有生物学活性，而CECROPIN/melittin具有抗菌活性。但有兔防御素基因在大肠埃希菌中成功表达的报道，获得的防御素也具有生物学活性。曾有人研究家禽防御素基因的原核表达，但发现以融合蛋白形式表达时，表达量达15.6%，而以非融合形式表达时，2h内表达产物电泳条带清晰，2h后表达产物电泳条带模糊，但没报道其产物的生物学活性。在原核表达时，防御素的N端或者C端增加了不必要的氨基酸，对其结构产生影响，导致生物学活性降低，而且对防御素二硫键的形成也不利。理论上将融合蛋白经酶处理后，降解释放出防御素分子，步骤繁琐。本来大肠埃希菌的表达量不高，一般只有mg/L水平，经过处理后获得的蛋白量更少。因此，研究者寻求防御素基因在真核微生物中进行表达。王义琴等将兔防御素NP-1基因导入小球藻，得到了具有正常生物学活性的NP-1，其表达产物对革兰氏阴性菌(大肠埃希菌)、革兰氏阳性菌(枯草杆菌)和真菌(镰刀菌)的生长均有抑制作用[18]。Almeida等(2001)年在毕赤酵母(Pichiapastoris)中成功表达了Pisumsativum防御素-1(rPsd1)，表达量高达13.8g/L，产物具有抗菌活性[19]，但与天然产物rPsd1对真菌的作用不一致。通过引物修饰设计酶切位点进行改造后，获得较好效果[20]。为进一步研究防御素基因的表达奠定了基础。鸡防御素基因在毕赤酵母中也成功得到表达，表达产物对大肠埃希菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用[5]。但毕赤酵母表达系统存在局限性，如分泌产物不一致，信号肽加工不完全，表达的蛋白容易降解，修饰功能同高等真核生物仍具有差别，表达时添加甲醇进行诱导，不符合食品级要求等，这些缺点限制了其应用。鉴于此，研究者寻求在动物细胞内表达防御素基因，这在COS-7细胞上得以实现，已有其他动物β-防御素基因在其中获得表达，表达的产物具有较好的生物学活性。也有将真核表达载体直接导入到体外培养的动物细胞或者动物体内(某些器官)进行表达的报道，为防御素用于防治疾病(如气管感染)打下基础。上述研究为利用基因工程手段，构建防御素表达载体，导入合适的宿主细胞，大量生产防御素，使其得以有效利用，并进一步深入研究探索禽类防御素的结构与新功能奠定了良好基础。　　6禽防御素的应用与展望　　禽防御素与哺乳动物防御素一样具有广谱抗微生物活性，其抗菌机理特殊，能穿透菌体细胞壁和细胞膜，最终引起细菌死亡，并且致病细菌不易产生耐药性。这与主要作用于微生物酶系统而起作用的传统抗生素截然不同，酶的基因突变就可导致细菌抗药性的产生。禽类防御素克服了这一难题，有可能开发出新的治疗药物，替代传统意义上的抗生素。　　此外，防御素还具有其他生物学作用，如调节宿主炎性反应，聚集其他淋巴细胞趋向炎性部位，起到治疗作用。防御素可与抗生素起协同效应，如酸链球菌肽和青蛙皮肤的ranalexin与抗葡萄球菌抗生素(如羟氨苄青霉素)联合应用，疗效更好。其他阳离子肽(如indolicidin与protegrin)与宿主防御分子(如乳铁传递蛋白和溶菌酶)同样具有协同效应。禽类防御素也具有抗炎功能，即可用作趋向因子，抑制炎性反应，也可作为信号分子，激活免疫防御和损伤的修复。这表明禽类防御素不但可以用于治疗疾病，也可以用作肉食品的保鲜剂以及其他用途，但须进一步研究证实禽类防御素的作用。