近几年，结合胞外选择技术，在细菌噬菌体和细菌表面展示多肽的表面展示载体的使用，能够产生和操作各种配体，如酶、抗体及肽。噬菌体展示是表达已融合到噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或多肽；细菌展示是表达融合到定位信号的重组蛋白。用这两个相辅相承的技术，可以设计全套配体，并用亲和选择法筛选到具有预期特性的配体。应用噬菌体展示，可合成、筛选到许多我们想要的蛋白（如融合肽、抗体、酶），这些蛋白具有预期的催化特性或结合亲和力或者具有用于胞内、胞外诊断、人体疾病免疫治疗和生物催化作用时所需的特异性。而细菌表面展示可广泛应用在各种抗原决定簇、异源酶、单链抗体及重组肽库的表达上。本文简述了噬菌体和细菌表面展示的基础，及这两个前导技术在生物技术领域的应用。 一、 噬菌体展示 噬菌体展示已证明是一有力的技术，去获得可容纳几万甚至几亿的不同肽或蛋白质的库，并已应用于重组肽库（识别肽受体配基）的亲和筛选，确定单克隆抗体的抗原表位，选择酶作用底物以及筛选克隆的全套抗体。 噬菌体展示的一成功应用是，用大的噬菌体抗体库分离单克隆抗体和片段。相应的在过去的几年中快速发展了许多有效的技术、方法，用于设计、构建大的抗体库及抗体的筛选。 使用最普遍的是感染阳性大肠杆菌的单链丝状噬菌体，利用其它噬菌体的展示系统也同时发展起来，包括在λ噬菌体头和尾，T4衣壳及MS2外壳的展示。单链丝状噬菌体将编码成千上万特异配体的DNA片段，插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中（通常为PⅢ,也有PⅣ、PⅥ或PⅧ），抗体基因与噬菌体基因连接后，抗体就会和外壳蛋白相融合，接着是将融合的外壳蛋白结合到新的噬菌体颗粒上，这些颗粒是在细菌周围间隙被装配的。基因融合产物和其亚序列结合到成熟噬菌体外壳后即被呈现在噬菌体表面，而遗传物质仍保留在噬菌体颗粒中。该技术将基因型和表型连在一起，将识别抗原和进行再扩增的能力结合起来，不经人体免疫，绕过杂交瘤，仅仅通过几轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选富集过程。即，展示相关配体的噬菌体与靶分子结合而被保留，未吸附的噬菌体则被洗去，吸附的噬菌体可以从表面再回收，再感染细菌，获得更大富集，最后进行结合分析。 噬菌体选择方法对于抗体或短肽的分离都不受限制，而且适用于其它具有生物活性的分子的研究，如细胞因子、受体、酶底物、酶抑制剂、抗体酶、DNA结合蛋白、构建具有特异性结合分子的受体域、以及纤维素结合域等。据报道，抗体的支架不同可形成用于各种类型分子的合适的结合配体，而且许多例子可说明，宿主支架可容纳许多有效的可调节一些合适的置换的区域，（可根据这点制备局部变化的库），这些支架包括：β-折叠蛋白、α-螺旋束蛋白、这两个蛋白的组合、以及绿色荧光蛋白（GFP）和纤维素结合域等。 噬菌体展示系统是用于确定随机位点及产生配体结合的可变区的首选策略，相关报道的还有λ噬菌体、细菌细胞展示和真核细胞展示方法的使用。若为具有功能性的选择研究，一般选择其它类型分子，而在需要有预期功能活性的亚细胞区域上，抗体表达和折叠已证实受到损害的抗体除外。还可设计用于胞外表达的抗体，例如，通过构建稳定的无二硫键的抗体或利用可在靶细胞器中产生的支架库得到有效的结构多样性。 二、 细菌表面展示 酵母菌细胞及哺乳动物细胞表面展示近年来也有一些报道，但这些研究还不够成熟，应用范围不够广泛，而细菌表面展示系统已成为快速发展的重要研究领域，异源蛋白在细菌表面展示正在成为微生物，分子生物学，疫苗学和生物技术研究的重要工具。 二十年前，异源表面展示已被首先证实，当短的基因片段被插入到大肠杆菌外膜蛋白LamB,OmpA和PhoE基因后，融合基因产物可进入重组细菌外表面 ，然而这些展示系统，多数情况下不适于展示过大的蛋白。不仅外膜蛋白，还有脂蛋白、菌毛蛋白、鞭毛蛋白、以及具有转位和表面锚定特别机制的蛋白等表达系统都可在革兰氏阴性菌，如E.coli和Salmonella spp上实现异源表面展示；相似的在革兰氏阳性菌上的异源表面展示有staphylococci,streptococci和mycobacteria。细菌表面展示亦被应用于产生作为环保的整个细胞吸附剂，特异生物催化剂，诊断工具，以及完全肽库的展示。然而，重组展示通常都采用噬菌体展示系统，很少用细菌展示系统，后者常用于有功能的活性的分子展示。 三、 革兰氏-阴性菌表面展示 在革兰氏阴性菌表面，用于异源蛋白表达的展示系统已得到发展，多数情况下，外源基因产物是融合到外膜蛋白上，如麦芽糖孔蛋白LamB，磷酸介质诱导的微孔蛋白OmpA，以及各类脂蛋白（如最主要的脂蛋白Lpp，脂蛋白TraT，结合肽聚糖的脂蛋白PAL）。革兰氏阴性菌中的丝状结构蛋白也已用于表面表达载体，包括菌毛蛋白（如FimA蛋白，Ⅰ型菌毛黏附素FimH），鞭毛蛋白和伞毛蛋白（PapA伞毛亚单位和F Pilin）。特定的展示系统是建立在具有转位和表面锚定特别机制的蛋白基础上的。来源于Klebsiella pneumoniae的脂蛋白支链淀粉酶已用在大肠杆菌上进行表面展示，用这个系统，目标蛋白可通过其N端脂肪酸部分短暂的锚定在外膜上，随后释放到培养基中。Neisseria gonorrhoeae IgA蛋白酶前体的β区域（Igαβ）和大肠杆菌AIDA-1也被用于各种不同异源蛋白的表面暴露。当作为C端融合部分使用时，Igαβ和AIDA-1可介导没有OmpT蛋白酶的Salmonella typhimurium和E.coli外表面的杂合蛋白的附属物，还有一特别感兴趣的系统是，Lpp –OmpA杂交展示载体，这种载体由主要脂蛋白（Lpp）N端外膜定位信号与外膜蛋白OmpA的一个结构域（有三或五个跨膜螺旋）融合而构成，外源蛋白通过与OmpA的C端融合而展示。Lpp –OmpA融合展示系统已成功地使几种分子量20-50Kd的蛋白质以可接近的形式展示在大肠杆菌表面。我们已知道的可以用Lpp –OmpA嵌合体展示的蛋白有：β-内酰胺酶（Bla）、单链Fv片段（scFv）、有机磷的水解酶（OPH）等。 四、 革兰氏-阳性菌表面展示 革兰氏阳性菌也可适合作为细菌表面展示系统，一些蛋白，如抗原决定簇，异源酶和单链Fv抗体（scFv）都可锚定到革兰氏阳性菌细胞表面。近来，多数研究工作一般都使用非致病性的在食品发酵过程中使用的葡萄球菌。Schneewind等阐明细胞表面定向和Staphylococcal细胞上的表面锚定机制后几年，异源表面展示已在staphylococci和streptococci上完成。并发现Staphylococcus蛋白A通过其C端表面锚定区展示到细胞表面，这一锚定区包含了一带电的重复区域、一个疏水区以及一个短的带电荷的尾。许多革兰氏阳性菌的表面受体的C端都有与SpA类似的结构，并且具有高度的同源性，表明它们以相同或类似的机制锚定于细胞表面。 建立Staphylococcus xylosus和 Staphylococcus carnosus上的表面展示系统都利用了蛋白A的细胞表面锚定区。Staphylococcus gordinii表面展示系统利用了streptococcus pyogenes的M6蛋白的相似C端区而完成不同杂合表面蛋白的表面展示。当Staphylococcal系统利用质粒载体进行基因表达时，是通过同源重组将靶基因结合到Staphylococcal染色体，而最近异源表面表达在Bacillus anthracis上也得到完成。 细菌表面呈现技术为构建新型全细胞生物吸附剂打开了方便之门，单链抗体、蛋白受体、金属结合蛋白等在细菌表面得到了呈现。Sousa等利用LamB呈现系统在大肠杆菌表面呈现了聚组氨酸，发现重组菌吸附Cd2+的能力比对照菌高11倍。由于这种生物吸附剂有着广泛的应用前景，特别适合于化学物质的分离纯化、重金属离子的吸附等环境方面的应用。 从应用角度而言，革兰氏阳性菌更具有潜在价值，这是因为：第一，革兰氏阳性菌呈现系统更适合于大分子蛋白的表面呈现，而革兰氏阴性菌呈现系统多是插入小肽，但是LamB 、Lpp –OmpA等系统呈现体系也能用于大分子蛋白的呈现；第二，蛋白在转运过程中仅有一层膜，而对于革兰氏阴性菌则有内、外两层膜；第三，革兰氏阳性菌外被一层厚且坚韧的细胞壁，在操作中更不易遭受破坏。但限制革兰氏阳性菌系统应用的一个重要因素是它的转化效率比革兰氏阴性菌低，不适合大容量抗体库和肽库的表面呈现。 五、 抗体表面展示 噬菌体展示是更主要的用于重组抗体的分离和操纵的工具，而细菌展示只是次要系统。重组片段形式的抗体是首先成功展示在噬菌体表面的蛋白，这一过程是将抗体可变区密码序列（编码单链Fv片段）与噬菌体基因Ⅲ（编码噬菌体次要外壳蛋白PⅢ）的氨基末端融合在一起。另外，融合到PⅧ（噬菌体主要外壳蛋白）的抗原结合片段（Fab）的展示也取得了成功。然而，PⅧ位点尽管对于肽噬菌体展示非常可行，但却不适于过大的多肽（如抗体）的有效展示，出于这个原因，多数抗体噬菌体展示系统多采用PⅢ位点。抗体首先用一噬菌体载体被展示，是以fd-tet基因组和融合部位基因Ⅲ为基础，在这个载体上，编码抗体单链Fv片段的基因是被克隆到带有基因Ⅲ和其下游信号序列的框架区。这一过程中，抗体VH和VL区域可正确折叠，并通过分子内二硫键保持稳定，两者配对形成功能性ScFv。 现在又构建了噬菌粒用以取代噬菌体，噬菌粒是在具有colE1的复制起点及可融合在完整基因Ⅲ的N端，也可融合在带有切口的基因Ⅲ的N端。其具有高转化效率，因此更适合制备大的全套抗体，还可省去了从质粒亚克隆到噬菌体抗生素选择标记的质粒上加上了单链噬菌体的主要间隔区。在噬菌粒上ScFv即这一繁琐的步骤。许多噬菌粒利用lac启动子调控抗体- PⅢ融合产物的表达，而在抗体- PⅢ产物展示过程中，葡萄糖作为lac启动子的分解代谢抑制物，被转移或耗尽会影响产生单价噬菌体颗粒的融合产物的表达。无论如何，需要考虑间接表达的毒性时，表达水平需要严格调控。这时结合了其它转录终止子的lac启动子、tet启动子或噬菌体热休克启动子（psp）等的使用，也许可允许相关毒性产物的展示。编码抗体- PⅢ融合物的噬菌粒DNA，通过辅助噬菌体（如M13KO7或VCS-M13）可优先被组装到噬菌体颗粒上。 表达抗体的结合价受多种因素影响，如外壳Ⅲ（cp3）和Ⅷ（cp8）均可用来表达抗体片段。其中的cp8是噬菌体的主要外壳蛋白,在每个噬菌体颗粒表面约有3000个拷贝分子，表达的抗体片段多为多价的噬菌体抗体。而cp3在噬菌体表达的拷贝数较少，约3-5个分子，多为单价表达，用不同的表达载体系统也可改变表达抗体的结合价。如用噬菌粒作表达载体，当由辅助噬菌体如M13KO7辅助其包装时，由于辅助病毒的cp3蛋白可竞争性的进入噬菌体颗粒,因此使噬菌体表达的结合价大为降低，推测这种噬菌体最多为一个融合蛋白，故称为“单价”噬菌体。而类似M13gⅢ这种缺失cp3基因的辅助病毒，其诱导的噬菌体抗体可为多价。 噬菌体抗体选择是通过多轮“吸附-洗脱-扩增”过程，回收、富集到具特定结合力的噬菌体上。从噬菌体抗体库中筛选表达特异性抗体的经典方法主要有两种：1、将纯抗原包被在固相介质上，如酶标板或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；2、将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉抗生物素蛋白的磁珠上对噬菌体进行筛选。这两种方法中，均需加脱脂牛奶（或BSA）封闭未被抗原占据的位点，以避免噬菌体非特异性的结合。在前一种方法中，回收与抗原特异结合的噬菌体可用碱性溶液（如三乙基胺）或酸性溶液（如甘氨酸-盐酸）洗脱，或用可溶的抗原或半抗原洗脱。在后一种方法中，主要是通过DTT破坏抗原与生物素之间的二硫键来洗脱。回收的噬菌体可再转染宿主菌，增殖后再进行下一轮筛选。一般经过3-5轮这样的筛选即可得到表达高亲和性的抗体克隆。 在近二十年，抗体噬菌体展示已成为抗体工程的前导工具，起初用于从各种靶分子中分离抗体的这一技术，现已发展成用于胞外操作抗体亲和力、特异性和稳定性的有效工具。抗体噬菌体展示的最成功的应用是从大的库中进行抗体分离，为了这个目的，三种类型的抗体库可被应用。 首先，免疫抗体库，是指利用从特定抗原免疫的动物或人体获取的淋巴细胞为材料所构建的抗体库。免疫抗体库对于筛选特定抗原的片段抗体是非常合适的，并已用于许多物种抗体库的构建，如鼠、人、兔、绵羊和鸡等。 但由于伦理道德的约束，人体除了用有关的疫苗免疫外，是不能随意进行免疫的，因而，发展了未经免疫的抗体库。这种抗体库进一步可分为天然抗体库和合成抗体库。天然抗体库的构建方法与免疫抗体库的构建相似，区别是作为抗体基因材料的B细胞是来自未经免疫的供体。已构建的几个天然抗体库，因它们不偏向任何特定抗原，而被用来分离抗多抗原抗体。而从天然抗体库筛选抗体，库容量的大小是一个关键因素，库容量越小，其筛选的抗体亲和力越低，因此必须构建非常大的库以获得高亲和力抗体。 第三种就是合成与半合成抗体库，这是一种未经免疫的抗体库，可通过在胞外装配抗体基因Ⅴ（带有D、J片段）而人工构建的。DJ片段含有编码CDR3环（具有随机序列和不同长度）的信息。从噬菌体库筛选的抗体并不总能应用于治疗或生物技术试剂，一些情况下，需要考虑到抗体的亲和力、价、特异性或稳定性，基于这些原因，噬菌体展示即被用来产生合成抗体库，并获得高亲和力抗体。 总之，噬菌体、细菌表面呈现技术在抗体工程、疫苗学等多个领域显示出广泛的应用前景，而且随着其自身的不断完善和新的载体系统的发展，必将发挥更大的作用。