乳中生物活性肽的研究进展 王岗1，黄玉翠2，焦翠霞3，白乙拉4(1.内囊古畜牧科学皖．呼和浩特010030；2.包头市包钢运输农场．内蒙古 包头014030；3.内蒙古伊利集团饲料厂 内蒙古 呼和浩特O10070；4.内蒙古草原工作站．内蒙古 呼和浩特010018) 摘要 生物活性肽是一种重要的生理调节驹，参与神烃蛆妖及机体的免疫调节，并且有促进细胞的增殖与生长、影响綦分的消化与吸收等作用。笔者重点综述了乳蛋白泺生物活性肽中的阿片肤类、免疫刺教肤、酪蛋白磷酸肚、抗血凝肤、抗高血压肽等的构成、功能及生理意义。 关键词：乳；蛋白质；生物活性肽；氨基酸 近些年来，对蛋白质在消化过程中水解生成的肽的作用傲了大量的研究工作，业已证实了蛋白质胃肠道消化释放产生的肽片段不仅能作为氨基酸的供体．而且也是一类生理调节物．它们可直接作为神经递质或间接刺激肠道受体激素或酶的分泌而发挥作用。在肽的活性作用研究中，对乳蛋白源生物活性肽的研究最为深入。 长期以来．乳蛋白只被认为是幼年哺乳动物氨基酸的主要来源。除了营养作用外。乳蛋白的生理重要性一直未受到足够的关注。直到1979年人们发现动物体内存在内啡肽之后，才开始了外源活性肽这一领域的研究．并迅速成为动物营养和生理界新的研究热点。目前，已从乳蛋白酶解产物中检测到了具有阿片活性、免疫调节活性、抗高血压活性、金属离子生物转化活性、抗凝血和舒血管活性及抗细菌活性等多种生物活性肽。近年来关于乳蛋白源生物活性肽的研究又取得了新的进展．鉴于此笔者对其作一综述。 L 阿片肽类 研究最多最早的酩蛋白生物活性肚是具有阿片活性的阿片肽。一系列命名为β-酪蛋白阿片肽的活性肽已被分离出来．它们是牛β-乳酪蛋白60-70氨基酸残基。其中活性最强的是五肽Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly。在人的β-酪蛋白中-Pro-Gly被一Val-Glu所代替。β-酪蛋白的阿片肽的衍生物(Morphlceptin，Valmuceptia或DcvMmueeptln)，通过它们C-末端氨基酸的酰氨化或通过D-型代替L-型而改动。其它在乳蛋白中发现的阿片样活性就还有：Exorphin （牛αs1-酪蛋白90-96片段），β- Exorphin （人酪蛋白41-44片段）。α-Lattarphin(人和牛α-乳清蛋白50—53片段)，β- Laetorphm(牛β-乳球蛋白102-105片段)。所有这些肽类均具有阿片肽样所有必需的结构，即Tyr-X-Phe或Tyr-Xl- X2-Phe(或Tyr_)。 Brantl等(1979)报道，豚鼠在饲喂一种蛋白酶解制剂时，回肠纵行肌毛细血管中存在一种阿片耿样活性物质。事实上，起作用的物质是一系列的β-酪蛋白阿片肽(β- Casomorphina，β-CM)。Ramabadran等(1989)总结β-酪蛋白阿片肽的药理学特性。在β-酪蛋白的镇痛活性和它们μ-受体的结合力之间存在着良好的相关性。耐受性、独立性、镇静、睡眠诱导、呼吸抑制、心动过缓及低血压等症状都是阿片肽样物质作用的结果。所有这些阿片样活性都在β-酪蛋白阿片肽或Morphiceptin中被发现。例如。在预处理的婴儿乳制品中，高含量的β-酪蛋白阿片肽和Morphiceptin会减少婴儿啼哭。并增加他们的睡眠。 对β-酪蛋白阿片肽已进行了许多体内研究。通过在大鼠颈动脉注射[3H]β-CM-5，Irmisch等(1983)得出结论，β-CM-5可自由通过血脑屏障而积累到一个相当高的程度。从新生牛犊血液中检测到了可能以前体物形式存在的大量的β- CM-7免疫反应物；成年人饮用牛奶后．在其小肠内容物中也检测到了此免疫反应物。 Chiba等(1989)发现在κ-酪蛋白中存在阿片样拮抗物，命名为Casoxins，包括：Caaoxin A(Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asp,牛κ-酪蛋白35-4l片段)、Casoxin B(Tyr -Pro-Tyr-Tyr,牛κ-酪蛋白58-61片段和人κ-酪蛋白3l-34片段)及Casoxin C(Tyr-Iso-Pro-Iso-Gln-Tyr -Val-Leu-Ser-Arg，牛κ-酪蛋白25-34片段)。豚鼠回肠实验表明，这些肽类具有纳络酮抗阿片肽活性的相同作用。 2抗血凝肽 血液的凝同和乳的凝集是两种重要的生理凝集过程，已有许多报道证实了这两种凝集现象之问的分子相似性(Jolles等，1982，1986)。Jolles等(1998)发现牛κ-酪蛋白与人纤维蛋白原γ-链具有结构的同源性。纤维蛋白原具有双重功能．它既参与血小板的凝集[纤维蛋白原与血小扳表面的特殊受体(糖蛋白Ⅱb-Ⅲa复合体GPⅡb-Ⅲa)相结合]，又参与纤维蛋白的形成。在血小板凝集过程中，已证实纤维蛋白原分子中有2个结台位点：一个是纤维蛋白原γ-链C-端片段(His-His-Leu- Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)；另一(或两)个四肽片段【Arg-Gly-Asp(-Set或-Phe)，纤维蛋白原α-链的572-575或95-98片段】。这2种肽都抑制血小扳凝集和纤维蛋白原结合到ADP活性血小板上(Andrieux，1989)。 Jolles等(1986)证明，相当于牛κ-酪蛋白106-116片段的天然或合成的十一肽(Met-Ala-Iso-Pro-Pro-Lys-Lys-Asp-Gln-Asp-Lys)抑制 ADP诱导的血小板凝集和纤维蛋白原的结合,并随浓度的增加而加强。牛κ-酪蛋白的十一肽具有比人γ-链的C-端十二肽更强的抑制性。此十二肽中含有2种相似的胰胨肽(Met-Ala-Iso-Pro-Pro-Lys-Lys-，106-112片段和Asp-Gln-Asp-Lys，113-116片段)对血小板凝集的作用很小。也不抑制纤维蛋白原的结合。 四肽(Lys-Arg-Asp-Ser)抑制纤维蛋白原的结台和血小板的凝集。把它与存在于人乳运铁蛋白中的四肽(Ars-Gly-Asp-Ser)作比较，发现2种肽都有很大的起始一个β-转折的可能性．并有很高的亲水性。Lys-Arg-Asp-Ser抑制ADP诱导的血小板凝集，它是通过一个独立于蛋白磷酸化的机制抑制血清紧张素的释放，及通过另一个机制(即此四肽不必与GPllb-IIIa复合体直接结合)抑制纤维蛋白原的结合，从而进一步抑血小板凝集。 3抗高血压肽 体内血压受肾素——血管紧张素系统调节。肾素作用于血管紧张素原释放出大量无活性的血管紧张素I。后者在血管紧张素转换群(ACE)的作用下转变成有活性的血管紧张素Ⅱ。Maruyama等(1987)发现4种活性肽具有ACE酶抑制活性和可能提高缓激肽活性的作用。它们分别是牛αs1-酪蛋白23-24、23-27和194-199片段．以及牛β-酪蛋白177-183片段。Kohmura等(1989．1990)从人β-酪蛋白中合成69种肽片段，从κ-酪蛋白中合成23种肽片段。体外试验表明，有抑制括性的肽位于人 β-酪蛋白39-52氨基酸片段和人κ骼蛋白63-65片殷，其中，人β-酪蛋白43-52片段(Ser-Phe-Gin-Pro-Gln-Pro-Leu-lso-Try-Pro)在体内括性最强。 4免疫刺激肽 乳是成年人饮食中一个重要的组成部分。对于新生婴儿来说。乳不仅是必需的养分来源，而且还是复杂的生物因子的最直接来源（例如：免疫活性细胞、酶、生长因子等）。新生儿的免疫活性细胞有其特有的缺陷，例如，多形核百细胞数量的减少和一些吞噬功能（趋化性、杀菌能力等）的减弱(Miller，1979)，T-淋巴细胞的活性降低。而它分泌几乎全部的免疫球蛋白M(IgM),对新生儿抵御细菌和病毒的感染有直接作用(Durandy等,1990)。而且,乳蛋白的酪解产物可能是生物活性肽的一个重要来源，例如免疫刺激作用(Migliom-Sttulotff等。1988；Miller。1979；Migliore—Samour等,1989)。它是继牛乳提取物中发现阿片肽后(Brant等，1979)，在人乳蛋白中第一个被发现的肽的生物活性。 免疫刺激肽是从人酪蛋白的胰蛋白酶——麋蛋白酶降解产物中分离得到的(Jolle等。1981； Parker等．1984)。激活吞噬功能的肽，根据它们的活性通过几种筛选试验而纯化出来．包括一个体外试验中刺激鼠腹膜巨噬细胞对绵羊红细胞(SRBC)的吞噬作用及一个体内试验中保护小鼠免遗肺炎菌的感染，从人酷蛋白酶解物中分离得到2种活性肽．即六肽Val-Gln-Pro-Iso-Pro-Tyr(人β-酪蛋白54-59片段)和三肽Giy-Leu-Phe．此三肽不在已知的人β-酪蛋白和κ-酪蛋白中，而是存在于另一种乳蛋白中，即α-乳清蛋白的51-53片段，与κ-酪蛋白一起作用，并一同被纯化(Maynard，1990)。这2种肽在很低的浓度条件下(0.1μM)就能激活鼠腹膜巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用(Berthou等，1987；Parker等，1984)。它们通过静脉注射可保护小鼠免受肺炎菌感染；六肽在O.5 mg/kg的低浓度下就有显著的活性，而三肽在静脉或皮下注射时，浓度达1mg／kg时才有活性。通过对人巨噬细胞的研究．也证实了这些肽能激活吞噬作用。它们能提高人血液中单核细胞和巨噬细胞对人血液中衰老的红细胞的附着力。这一作用在0.2μM浓度下就很明显地表现出来．并随浓度增加而加强(Guttegao等，1988)。 从牛酪蛋白中易分离得到2种免疫刺激肽，即三肽Leu-Leu-Tyr(牛β-酪蛋白191-193片段)，和六肽Thr-Thr-Met-Pro-1eu-Try(αs1-酪蛋白C-端片段)。Leu-Leu-Tyr以相似于三肽Gly-Leu-Phe的浓度刺激鼠腹膜巨嚆细胞(Berthou等，1987),Thr-Thr -Met-Pro-Leu-Tyr则在试验中活性很高(0.05μM)(MigIiore-Samour等,1989)。另一个六肽Pro-Giy-Pro-lso-Pro-Asp(牛β-酪蛋白63-68片段)．也能刺激吞噬作用。β-酪蛋白的这一部分，含有几种不同的生物活性肽，被命名为“战略带”。 另一个刺激免疫系统的酪蛋白肽是血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)的抑制剂。此酶催化血管紧张素Ⅱ的活性．而饨化缓激肽。后者能刺激巨噬细胞以增强淋巴细胞的转移和淋巴因子的释放(Paegelow等，1986)。ACE的抑制剂对缓激肽有利，因此作为免疫刺激物。Maruyama等(1985)从牛酪蛋白的酶解产物中分离得到凝血酶原肽(CEI)为ACE的抑制荆，分别是CEI 12(αs1-酪蛋白23-24氨基酸片段)、CEl 5(CEI 12的末端三肽)、CEIβ7(β-酪蛋白177-183片段)及αs1-酪蛋白C-末端六肽(Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Tyr)。Kohmura等(1 989)研究了C-末端脯氨酸残基的合成肽抑制ACE的潜力。这些肽是从人β-酪蛋白中选出的。β-酪蛋白富含脯氨酸片段，它们中的几种在人、牛、水牛和羊酪蛋白中位置相近。在研究肽对ACE活性的抑制中，六肽Phe-Val-Glu-Pro-lso-Pro是完全钝化的，说明人六肽Val-Glu-Pro-lso- Pro-Tyr 的免疫刺激活性有另一种机制。另一种由绵羊初乳的乳清中分离出的富含脯氨酸的多肽(Prp)也具有刺激或抑制免疫反应的调控作用。最近，一个九肽片段Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro从Prp的胰凝乳酶解物中分离出来。对应其组分合成的肽和其C-末端的五肽及六肽显示出与PrP相似的免疫调控活性(Janusz等，1987)。 5酪蛋白磷酸肽 酪蛋白磷酸肽 (CPPs)分布于αs1，β-酪蛋白等牛乳蛋白的不同区域，其活性中心是成串的磷酸丝氨酸和谷氨酸簇。经酶解所产生的CPPs的功能区结构主要有：αs1-(43-58)2P、αs1-(59-79)5P、αs1-(46-70)41'、β(1-25)4P、β(1-28)4P及β(33-48)1P(Manson等,1979；Berrocal等,1989；Kitts等．1992)。由于CPPs在中性和碱性pH时通过丝氨酸磷酸与钙、锌、铁等离子结合，由小肠脑壁细胞吸收后再释放出来．从而有效地避免了钙在小肠中性和偏碱性环境中教沉淀，促进了钙的吸收。 Mellander(1950)发现，患有佝偻病的小孩服用酪蛋白的胰酶消化液可以强化骨骼的钙化。 Reeves薄(1958)的动物体外试验表明，CPPs可以在中性和偏碱性条件阻止钙的沉淀，从而促进钙在小中的吸收。Lee等（1980）和Sato等(1985，1986)也先后证明CPPs确实具有促进钙质吸收的功能。Sato用含有CPPs的食物饲喂大鼠。并在食物中加入同位素标记的钙，发现其大腿骨胳中的标记钙明显高于对照组。此后，通过对大鼠、小鼠、鸡、猪和人的实验，都证明CPPs具有明显促进钙、铁、锌吸收功能(Hanson等，1997；等Ashida等,996)。 Thwaites(1991)还证明CPPs具有明显的扰蛀牙功能。最近,Nagai等(1996)和Moil等(1996)通过体外试验进一步证实了CPPs还可以明显地促进精子进入卵细胞和体外精卵细胞融合。Tsuchlda等(1996)还证明CPPs具有防止钙质丢失的作用。 6其它生物活性肽 κ-Cseinoylycopeptide几乎是消化开始第1小时内产生的唯一的肽。Stan和Chernik(1982)报道其具有抑制大鼠胃酸分泌及胃泌素释放的功能。此肽还能减弱蛋白水解活性，此它同时抑制消化道的流动性。 Lahav(1967)报道，一种酪蛋白水解物具有抗菌特性，并说明牛αs1-酪蛋白的1-23片段有此功能。Fiat等(1989)证明．对应于para-κ-酪蛋白的C-末端片段是胰凝乳蛋白酶的抑制剂。五肽Pro- His-Leu-Ser-Phe(牛κ-酪蛋白的10l-05片段)是最强的混合物。Azuma等(1989)发现一些人β-酪蛋白的特殊片段(1-18位片段，Arg-Gln-Thr -Iso-Gln-Ser-Leu-Ser-Ser-Ser-GLn-GLn-Ser-Iso-Pro-Gln-Tyr-Lys和105-117片段GLn -Pro-Thr-Iso-Phe-Phe-Asp-Pro-GLn- Iso -Pro-Lys)具有刺激BALB／C3T3鼠细胞DNA合成的功能。 7小结 乳源蛋白的酶解产物是提供大量短肽的重要来源．这些肽对新生儿的生长发育和成年人的某些生理机能具有重要的意义。目前，对于进人肠遭的生物活性肽是否具有显著生理意义还不十分清楚，一些肽(β-酪蛋白阿片肽)已在吸乳后的初生牛犊血浆中及成年人饮用牛奶后的小肠液中检测到了。并且．已有大量无可辩驳的证据表明，正常情况下吸收时会有少量的完整肽和蛋白质进人循环系统． 将来，这些乳肽可能作为食品添加剂，也可用于药物生产，用于矿物质吸收障碍和免疫缺乏的治疗．发挥其免疫调节、抗血栓、抗高血压、抗菌等性能。总之．乳蛋白源生物活性肽具有广阔的开发应用前景。