摘 要 以大豆分离蛋白（SPI）为原料，分别在70、80、90℃条件下经6mol/l的盐酸水解2~10、12、24、48h，对各水解产物的α-氨基氮与总氮的比值（α-NH2-N/TN）、水解产物分子量分布范围及适宜水解条件下终产物二肽、三肽含量进行了测定。结果表明，酸水解明显受反应温度和时间影响，提高水解温度，可缩短达到平均肽链长度（APL）为2所需的时间适宜水解条件为温度90℃、反应时间5h，终产物二肽、三肽含量为19.38%。　　关键词 大豆分离蛋白；盐酸；水解；小肽；制备　　小肽的制备方法，主要有人工合成和蛋白质水解。人工合成的小肽产品成本太高，不适合作饲料添加剂。蛋白质可经酸、碱和酶水解生成小肽。酶作为具有生物活性的特殊蛋白质，对反应条件要求苛刻。温度、环境pH值、重金属离子、有机试剂、紫外线、表面活性剂等能引起蛋白质变性，从而使酶失效。因此，酶促反应大都要求在一定的温度范围、反应时间、pH值下进行，且酶水解效果的好坏与底物浓度、酶用量、预处理、溶液中有无金属离子等因素有关。同时，在水解过程中酶常常会逐渐变性失活，致使酶活力随时间而降低；酶解产物也会对酶起抑制作用，特别是蛋白水解酶会发生自溶（自身水解）现象，导致生产效率下降。因此，酶法水解蛋白质的主要缺点是生产周期长且水解度不高，所得产品以大分子多肽为主。　　碱水解时，丝氨酸、苏氨酸、精氨酸等大部分被破坏，且大部分氨基酸都会发生消旋作用，所得为D型和L型氨基酸的混合物，营养成分损失大。由于机体只能吸收L型（左旋）氨基酸（蛋氨酸除外），因此，很少采用此法来制取供人类或动物食用的水解蛋白。其应用主要限于对蛋白质水解改性，借以生产非营养目的的产品，如蛋白灭火剂、发泡剂等。相对而言，酸水解速度快、反应完全彻底，且不会引起氨基酸的消旋作用。但用酸水解法制备小肽的研究，国内外未见报道，故本研究选用酸水解。1　材料与方法1.1　试验材料1.1.1　试验原料与主要试剂　　大豆分离蛋白（SPI，由哈高科大豆蛋白公司提供）；盐酸、氢氧化钠、甲醛等均为分析纯，市购；葡聚糖凝胶（Sephadex）G-25。1.1.2　试验主要仪器设备　　恒温烘箱、高效液相色谱仪（Waters公司）、氨基酸分析仪（HP1100）、PHS-3C型数显酸度仪（上海雷磁）、UV-754型数显紫外分光光度计（上海）、HL-2型恒流泵（上海）、部分收集仪（日本岛津）。1.2　试验设计　　采用两因素3×12试验设计，将适量SPI溶于6mol/l盐酸后，分别在70、80、90℃条件下各水解2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48h（见表1），以α-氨基氮占总氮（α-NH2-N/TN）的比例达50%左右为判据，并用葡聚糖凝胶G-25对水解产物进行层析，确定酸水解的适宜条件；测定水解产物中游离氨基酸（FAA）、总氨基酸（TAA）和SP（二肽、三肽）的含量。1.3　测定指标及方法　　α-氨基氮（α-NH2-N）含量用甲醛滴定法测定；总氮（TN）用凯氏定氮法测定（陈钧辉等，2003）[1]。　　葡聚糖凝胶层析：用Sephadex G-25对水解产物进行层析，选用pH值7.0的磷酸缓冲液，流速1ml/min，4ml/管，洗脱液于280nm处比色测定OD值。测定适宜酸水解条件（α-NH2-N/TN为50%左右时）所得产物中二肽、三肽总含量及FAA和TAA的组成与含量。二肽、三肽含量由中国科学院成都分院分析测试中心测定（Waters公司HPLC）；AA含量由四川农业大学动物营养研究所分析测试中心测定（HP1100）。计算平均肽链长度（Adler-Nissen，1986；Hyung等，2000；邓勇等，2001）[2-4]，相应公式如下： 　　平均肽链长度（APL）=TN/(a-NH2-N)。1.4　数据处理　　用Excel XP对数据进行初步处理，以SPSS11.0统计软件对数据进行回归分析，建立不同温度条件下水解时间对α-NH2-N/TN或APL的回归方程。2 结果与分析2.1 酸水解SPI的时间和温度对α-NH2-N/TN和APL的影响（见表2）　　对表2数据的分析表明，α-NH2-N/TN与水解时间和温度存在极显著正相关（P＜0.01）。反应温度相同，α-NH2-N/TN随水解时间延长增加（图1），平均肽链长度逐渐降低（图2）。温度不同，肽键断裂均明显呈现由快变慢，逐渐趋于平缓的相同水解变化过程。　　不同温度条件SPI酸水解α-NH2-N/TN（%）与时间的回归方程及按回归方程预测达到APL为2所需时间见表3。　　由表3可见，提高水解温度可减少达到APL为2时所需的时间。因此，在本实验条件下，90℃为适宜水解温度；根据此条件下拟合度最好的对数（log）曲线方程，确定5h为达APL为2的水解时间，并对水解产物分子量范围和小肽含量进行分析。2.2　水解产物的葡聚糖凝胶G-25层析　　　将可溶性大豆分离蛋白及其水解后APL为2时的产物经葡聚糖凝胶G-25层析，并与相同条件下牛血清白蛋白、麦芽糖和三羟甲基氨基甲烷的层析结果进行对比。牛血清白蛋白、麦芽糖和三羟甲基氨基甲烷层析洗脱液的最大紫外吸收峰分别在第3管、第7管和第7管，而可溶性大豆分离蛋白及其酸水解产物（APL=2）则分别在第4管和第7管，可见水解产物的分子量以小肽为主。2.3　HPLC测定小肽的含量　　经中国科学院成都分院分析测试中心测定（Waters公司高效液相色谱仪），本试验适宜条件下SPI水解产物（APL=2）中二肽、三肽含量为19.38%。3 讨论　　本试验结果表明：温度和时间对酸水解程度有较大影响，其中温度的影响更大。不同温度条件下，SPI的水解反应主要发生在最初几个小时，此后随时间的延长水解程度趋于平缓，在低温（70℃）时这一特征更加明显；而在相对较高的温度下，不仅最初水解速度快，而且随时间的延长水解程度仍有一定的增加。这可能是工业上用酸水解生产氨基酸时一般在100℃以上的原因。高文宏（2001）[5]认为水解温度和水解时间是影响水解率（α-NH2-N/TN）的主要因素，且有显著的交互作用，而盐酸浓度和盐酸摩尔比对其影响不大。杨继良等（1995）[6]的研究表明，水解温度低于85℃则水解时间相对较长，若水解温度高于140℃，水解时间可大大缩短，但氨基酸破坏严重，同时对设备要求很高，并推荐植物蛋白水解温度以85~95℃为佳。由于水解温度的升高或水解时间的延长都会增加对氨基酸的破坏程度，因此本研究以90℃为适宜水解温度，5h为最适水解时间。　　一些侧链基团较大的氨基酸肽键的水解速度较慢，因此，在相同温度条件下，反应后期水解程度随时间的延长趋于平缓，如缬氨酸、异亮氨酸、色氨酸肽键的水解速度比甘氨酸肽键的水解速度要慢。这是因为较大的侧链对肽键起到一定的保护作用，它们的空间阻挡效应降低了肽键邻近空间内水合氢离子浓度。据报道，蛋白质在经过20h的水解之后，这类氨基酸的游离量还是较低，需将水解时间延长，才可全部游离。　　本试验所得水解产物中含大量因中和反应而产生的盐，若能除去其中的盐并分离游离氨基酸，则小肽含量可提高3倍以上。除盐和分离氨基酸的工艺还有待于进一步研究。4 结论　　大豆分离蛋白的盐酸水解明显受反应温度和时间的影响，提高温度能缩短水解达平均肽键长度为2所需的时间；适宜的水解条件为反应温度90℃，反应时间5h，终产物二肽、三肽含量为19.38％。