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乳铁蛋白及其活性多肽研究进展
发布日期:2010-11-30  来源:全球肽网  浏览次数:1079
乳铁蛋白及其活性多肽研究进展《广东饲料》2004年04期华南农业大学动物科学学院 王 飞 温刘发 从动植物的天然产品中寻找耐热活性因子,是饲料科学一个新兴的研究方向。家畜乳中含有多种具抗菌作用的蛋白质分子,对母畜的自身免疫及维持初生仔畜的胃肠道健康起重要作用。乳铁蛋白(fortoferrin,简写为LF)是Groves于1960年首先从牛乳中分离获得,由于乳铁蛋白与铁结合形成红色的复合物,故始称红蛋白。1961年Blanc和Isliker将他们从人乳中分离出来的此种蛋白命名为乳铁蛋白。另有学者根据乳铁蛋白

乳铁蛋白及其活性多肽研究进展《广东饲料》2004年04期华南农业大学动物科学学院 王 飞 温刘发 从动植物的天然产品中寻找耐热活性因子,是饲料科学一个新兴的研究方向。家畜乳中含有多种具抗菌作用的蛋白质分子,对母畜的自身免疫及维持初生仔畜的胃肠道健康起重要作用。乳铁蛋白(fortoferrin,简写为LF)是Groves于1960年首先从牛乳中分离获得,由于乳铁蛋白与铁结合形成红色的复合物,故始称红蛋白。1961年Blanc和Isliker将他们从人乳中分离出来的此种蛋白命名为乳铁蛋白。另有学者根据乳铁蛋白转运铁的功能将其称为乳转铁蛋白(betobosfer.Rin) Lfcin B是牛乳铁蛋白在消化道正常生理条件下释放出的一种含25个氨基酸残基的抗菌肽,在水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构,具有耐热、在消化道中不易降解、无抗原性、免疫调节作用、广谱抑菌和对肠道有益菌无害等特性,是研究抗菌肽结构——功能关系的理想对象。 1 乳铁蛋白的生物功能 乳铁蛋白是一种分子量为70~80 KDa的铁结合蛋白,由一条多肽链构成,其多肽链分子上附有两条碳水化合物侧链。其碳水化合物含量约为7%,其组成有甘露糖、半乳糖等。每个分子上有两个铁结合位点。在牛的初乳及干乳期乳腺分泌物中含量丰富,初乳中含量为0.6 g/mL。此外动物体的外分泌物中如泪液、精液、滑膜液及嗜中性白细胞颗粒中也有乳铁蛋白存在。乳铁蛋白主要由乳腺上皮细胞合成,少量来自多形核白细胞。它与血清转铁蛋白(transferrin)在化学性质、抗菌特性等方面相似,但二者在氨基酸组成、抗原性和免疫作用方面存在很大差别。乳铁蛋白具有广泛的生物学功能,如调节铁离子的吸收;参与某些炎症反应和对机体免疫系统进行调节,有广谱抗菌作用;还具有抗病毒,调节补体系统,促进细胞增殖等作用。 2 乳铁蛋白活性多肽的发现及结构 乳铁蛋白最重要的生理功能就是其优异的广谱抗菌性,近年来人们通过对乳铁蛋白的大量临床研究已经充分证明了这一点。家畜乳中各种蛋白质在哺乳仔畜的消化道中要经过非常复杂的降解过程,甚至在乳腺组织中部分蛋白质就会被蛋白水解酶如纤溶酶(Plosndn)作用而发生部分水解。随着研究的深入,人们发现乳铁蛋白在水解后会产生某些具有特殊生理功能的小肽——活性多肽,它的抑菌效果是乳铁蛋白的400倍。Kuwa-ta等(1998)发现这种活性多肽是含25个氨基酸残基的抗菌肽,这表明Lfcinb是动物消化道正常生理条件下释放出的,一些学者认为 Lfcin B是某种抑菌成分的前体物质。Suzuki等(1989)研究表明,用胃蛋白酶或胰蛋白酶处理乳铁蛋白,尽管很容易破坏乳铁蛋白的铁结合能力和抗原性,但却不能消除乳铁蛋白的抗菌活性。这说明乳铁蛋白的某些酶解片段仍然具有活性,并有可能在幼畜胃肠消化道中继续发挥其抗菌作用。Toinita等(1990)研究了牛乳中乳铁蛋白经蛋白酶水解后活性多肽的抑菌性能,发现经猪胰蛋白酶作用水解得到的小分子多肽具有广谱的抑菌效能,可以抑制一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长,水解多肽的抑菌活性明显高于乳铁蛋白。向活性多肽中添加 Fe3+其抑菌活性并不会降低,这一点与乳铁蛋白的抑菌表现完全木同。Saifo等(1991)研究发现,乳铁蛋白在pH=4.0酸性条件下对热处理具有较强的耐受力,但在pH=2.0时热处理,则会导致乳铁蛋白发生不同程度的水解,水解率达 10%时的产物(120℃水解 15 min)在 10μg/mL浓度条件下,表现出比未经酸热处理的乳铁蛋白更强的抗菌活性。具有抗菌活性的乳铁蛋白水解产物木具有结合铁离子的能力,并且比天然乳铁蛋白的抗原性低,但在富含铁离子的培养基中仍可保持抗菌活性,表明它具有与乳铁蛋白不同的抗菌机制。用反相高效液相色谱分离该水解产物,发现了分子量约为5000道尔顿的具有极强抗菌活性的小肽,它的抗菌机制与乳铁蛋白的不同之处在于其抗菌活性与铁离子螫合物无关,从而推测在乳铁蛋白上有一些抗菌位点,这些位点存在于乳铁蛋白的活性多肽上,并在乳铁蛋白发生部分水解时被激活,显示出很强的抗菌作用。 Bellmp从乳铁蛋白分子的N末端进行分离,分别得到了人乳和牛乳乳铁蛋白的活性多肽,并分别命名为 betoferricin H(简称 Lfcin H)和 forto.fetricinB(简称 Lfcin B)。 Lfcin B的相对分子量为3100道尔顿左右,由25个氨基酸残基组成,其氨基酸序列如下: Phe- Lys- Cgs- Arg- Ars一Gin-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-ho-Gly-Ala-Pro,Ser-lie-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe。 Lfcin H包含许多流水键和带正电的残基,其中的两个半眈氨酸通过二硫键相连接,此二硫键在乳铁蛋白中也存在,但对抑菌活性并无明显影响。 Lfcin H含有47个氨基酸残基,其中也拥有与 Lfcin B相同的区域组成。这一区域是使乳铁蛋白具有抑菌活性的特征结构。Lfcin B的抑菌效果要比 Lfcin H强。 Hwang等研究了 Lfcin B溶液的三维结构,通过 NMR分析发现,LfcinB的空间构象为扭曲的反向平行的β一折叠。对照乳铁蛋白的衍射分析,乳铁蛋白的结构为α一螺旋结构。由此可以解释正是由于α一螺旋结构向β一折叠的转化,导致了 Lfcin B的抑菌活性强于乳铁蛋白,因为β一折叠构象更易于贴近细菌表面,从而有了更多与细菌接触的机会。进一步的研究结果证明:不同动物乳中的乳铁蛋白在动物消化道中都能释放出与 Lfcin B相当的 Lfcin,如 bLf释放 Lfcin B,人乳铁蛋白(hu-manlactofemn,hLf)释放 human lactofemcill(hLfci或 Lfcin H),鼠乳铁蛋白(murine lactoferrin,InLf)释放 murine lactoferricin(rnLfin或 Lfcin M)和山羊乳铁蛋白(capri。 ltofetrin,eLf)释放 capnnel。to-ferricin(cLfci或 Lfcin C)。不同动物的 Lfcin氨基酸残基序列具有高度同源性,相当于bLf中的17~41残基部分,且均能裂解大肠杆菌细胞膜,杀灭细菌( Vorland等,1998;Venkitanapanan等,1999)。 3 Lfcin B的理化特性和生物学特性 3.1 LfcinB含25个氨基酸残基,其中有许多正电基团和疏水基团,分子量为3108道尔顿,为bLf的第17至41位氨基酸残基组成的裂片肽,其一级结构在水溶液中为两个反向β折叠(无α螺旋),且疏水基团(FI、C3、W6、WS、P16、118和C20)多集中于β折叠的单一侧,其可能的抗菌机理与此结构特点有密切关系(Hwap等,1998)。 3.2 能耐受动物消化道内蛋白酶或多肽酶的降解作用。 3.3 LfCin B的亲水脂性也赋予其乳化功能,这对营养物质消化吸收有益(Wu等,1999)。 3.4 Lfcin B属小分子活性物质,不会引起动物抗原性反应(Shimazaki等,1996)。 3.5 Lfcin B具有比 bLf更强和更广谱的杀菌能力。 Lfcin B能有效抑制革兰氏阴、阳性细菌,如大肠杆菌、奇异变形杆菌、、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、结肠耶氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉棒状杆菌,还对真菌(如白色念珠菌)、病毒、弓形虫和肿瘤细胞等有抑制作用,且其作用远较bLf强,能有效地保护用弓形虫攻击的小鼠,减少受试鼠的弓形体病发生率和死亡率;可促进抗生素穿越细菌细胞膜,与多种抗生素具协同作用(Isdrid等,1998 Yoo等,1998;Vorland等,1999 a, 1999 b, 1999 c)。 3.6 对肠道菌的抑制作用具选择性。动物肠道有益菌如粪链球菌、双歧杆菌和乳酸菌等对LfcinB具强抗性(Bellamr等,1992)。 4 乳铁蛋白活性多肽的实验室制备 牛乳铁蛋白(50g/L)的水溶液,用lmol/L的HCI调pH至3.0,加入3%胃蛋白酶,于37 ℃下水解4 h,80℃加热 15 min终止反应,加入 lmol/L的 NaOH调 pH至7.0,非可溶性多肽经 15000 r/min离心30 min获得,水解产物用 ThK- GEL 120T柱(D 6.0 mm x 150 mm)分离,再经 COS- MOSI5 CN. R柱(D 6.0 mm x 150 mm)纯化,冻干,所得活性多肽的纯度大于95 %。 5 乳铁蛋白活性多肽的抑菌机理 虽然乳铁蛋白和乳铁蛋白活性多肽的抗菌作用广为人知,均属广谱抑菌剂,即抑制需铁的革兰氏阴性菌(如沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏菌等),也抑制革兰氏阳性菌(如单细胞李斯特菌、葡萄球菌等),但是其抑菌机制尚不清楚。目前较普遍被接受和认可的为以下两种机制。 5.l钱的竞争性结合机制 乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白,可以与病原微生物竞争性地结合铁离子,使其失去赖以生存的铁离子,造成微生物生长的铁缺乏,从而导致其最终死亡。 5.2 细胞膜渗透机制大量研究结果表明,乳铁蛋白同多负电荷糖胺多糖结合(如肝素)。带正电的Lfcin与带负电荷的磷脂和脂多糖有很强的亲和性,它们能与细胞膜结合在一起,具有亲膜活性,从而增强了细胞膜的通透性,这种作用与Baillus POlylnyX产生的具有抑菌活性的多粘素 B的亲膜特性相似。Lfcin对微生物的致死作用体现为脂多糖的释放,细胞质膜的生理功能受到彻底破坏。由于细胞壁中有负电荷成分(如磷酸脂质体)的存在,会和带正电荷的Lfcin结合,阻碍了Lfcin进入细胞质膜的致死靶位。在乳铁蛋白及Lfcin与细胞表面的致死靶位结合过程中,离子性的反应起着重要作用。碳酸盐可明显增加它们的抑菌作用,而柠檬酸盐会减弱它们的抑菌作用,这是两者竞争铁离子的结果。 6 展望 近年来大量的研究成果使我们对乳铁蛋白及其水解产物抗菌作用有了更深入的认识,对乳铁蛋白水解片段的氨基酸序列、空间构象的测定及对乳铁蛋白抗菌作用的分子机制的初步了解,使得运用基因工程技术在家畜乳腺或微生物中高效表达乳铁蛋白或乳铁蛋白的水解活性片段成为可能。 Lfcin B对动物的独特生物学功能和理化特性赋予其可作为抗菌类饲料添加剂研发的对象,但至今对Lfcin B的一级结构——功能关系尚不完全清楚。如能以 Lfcin B基因作模板,经多点定点突变表达于酵母中,可生产足够量的 Lfcin B及其类似物,用于抗菌肽——功能关系研究,为未来在医学、食品科学、化妆品研制和畜牧兽医学等领域走向研发抗菌类高科技产品打下基础。研究Lfcin B及其他动物内源性抗菌肽的结构——功能关系,并在此基础上研制专门化和系列化的动物内源抗菌肽制剂,对我国畜牧业的可持续发展具有极其重要的意义。

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