乳蛋白生物活性肽研究进展作者：石 岗 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100089 乳蛋白是人类膳食蛋白质的重要来源，是一种营养全价的蛋白质，因而人乳和牛乳是最接近“完善”的食品。自从Brantl等［1］证明牛乳蛋白酶解产物具阿片肽活性以来，人们开展了对牛乳、人乳以及植物蛋白来源的生物活性肽的研究，并迅速成为动物营养学和生理学界新的研究热点。随着对乳蛋白源生物活性肽的潜在生理学效应的不断发现，目前对于乳蛋白质的认识已远远超出了单纯营养的概念。本文就近年来国内外对乳蛋白生物活性肽方面的研究做一概述。? 1 阿片肽(Opioid peptides) 阿片肽分为内源性阿片肽和外源性阿片肽两大类型。内源性阿片肽［2］是存在于人体脑、神经末梢的吗啡样作用物质，它们能在体内合成，作为激素和神经递质与体内的μ、δ、κ受体相互作用，其特征是N末端具脑啡肽序列（Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu），具有镇痛、镇静、调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温、消化系统及分泌等作用，如脑啡肽、内啡肽和强啡肽等。外源性阿片肽［3］是存在于外源性食物中，其阿片活性同吗啡一样能被纳洛酮所逆转的物质，它们可刺激胰岛素和消化道生长抑素的分泌、调节动物行为、促进肠道吸收水分和电解质、调节消化道运动、刺激摄食、抑制呼吸和调整睡眠模式。? 阿片肽类是最早在酪蛋白酶解产物中被发现的生物活性肽，也是目前研究最深入的一类。1979年，Brantl等首先报道豚鼠在饲喂一种酪蛋白酶解制剂时，回肠纵行肌毛细血管中存在一种呈阿片肽活性的物质，它是含有7个氨基酸残基的寡肽（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile），为β-酪蛋白第60～66氨基酸残基片段，命名为β-酪啡肽-7（β-Casomorphin-7，β-CM-7），它与μ型受体具有良好的亲和力，并呈现出阿片肽类所具有的特征，如依赖性、呼吸抑制性等。很快人工合成了β-CM-7和它的同系物β-CM-6，β-CM-5，β-CM-4，并证明β-CM-5（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly）在豚鼠回肠中具有最强的阿片活性。随后证明牛α-酪蛋白第90～96氨基酸残基片段（Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu）也具有阿片活性，并证明人的β-酪蛋白的第51～57氨基酸残基片段（Tyr-Pro-Phe-Val-Glu-Pro-Ile）排列顺序与牛的β-CM-7相似，只是第4、5位由Val-Glu取代了Pro-Gly，其阿片活性比牛β-CM-7低4～5倍。Meisel等［4］从饲喂牛酪蛋白的微型猪空肠食糜中分离到一个阿片肽，称β-CM-11，为β-酪蛋白第60～70氨基酸残基片段，它是β-CM-7的前体，其结构为Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Leu，在多种动物的乳蛋白中具有保守性。几种肽链较短的β-CM均是十一肽自羧基端水解不同数目氨基酸残基后的产物，它在阿片肽受体分析中显示很高的亲和性。这种肽被认为可能直接作用于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的运动或者作为胃肠道激素的外源性调节剂，也可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽，穿过肠粘膜进入外周血液，再透过血脑屏障与脑中的阿片肽受体结合，即使是成年人在大量饮用牛奶后，在其小肠内容物中也能检测到显著量的该种阿片肽的免疫反应物。 通过C末端的酰胺化作用或被D-氨基酸代替可获得β-Casomorphin的衍生物，其它阿片样活性肽包括Exorphins，β-Casorphins，α-Lactorphin，β-Lactorphin等。所有这些肽序列中Tyr-X-Phe或Tyr-X-X-Phe或Tyr是阿片样肽活性所必需的，这一发现对于人们研究及合成麻醉类药物非常有意义。? 酪啡肽（Casomorphin）同吗啡类的作用一样，具有镇静止痛、诱导睡眠、延长胃肠蠕动和刺激胃肠激素的释放等功能。Mantl等给小鼠脑内注射β-CM，可以产生痛觉丧失，且通过小鼠的试验证明高疏水的酪啡肽碎片可以通过血脑屏障。在预处理的婴儿乳汁品中，高含量的β-CM-7及其衍生物会减少婴儿的啼哭并增加他们的睡眠。Schusdziarro［5］用100mgβ-CM-4-amide和食物一起喂狗，可抑制肠的蠕动，50mg剂量时可抑制人的肠蠕动，而后者的剂量相当于临床治疗腹泻的剂量，说明β-CM可用于临床治疗腹泻。他还证明β-CM能刺激饲后猪的胰岛素、胃泌素和胰多肽水平，从而影响新陈代谢。? 2 免疫调节肽(Immunostimulating peptides)? 在酪蛋白酶解产物中发现的第二种活性肽类就是免疫调节肽，由Jolles等［6］首先从人酪蛋白的胰蛋白酶-糜蛋白酶降解产物中分离得到，这类肽类具有刺激巨细胞吞噬绵羊红细胞的功能。Maynand从人酪蛋白中又分离得到两种活性肽，即六肽Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr（人β-酪蛋白54-59片段）和三肽Gly-Leu-Phe（α-乳清蛋白51-53片段）。这两种肽以极低的剂量（如0.1μm）就可通过鼠腹膜巨噬细胞激活绵羊红血细胞的吞噬作用［7,8］,六肽以0.5mg/kg的剂量、三肽以1mg/kg的剂量腹膜或皮下注射可使老鼠免受Klebsiella pneumoniae的感染。这种活性在0.2μm的剂量就非常显著且存在剂量关系。人们已测得了人吞噬细胞对两种肽的特殊结合位点。? 从牛酪蛋白中分离出的免疫调节肽有：三肽Leu-Leu-Tyr（β-酪蛋白191-193片段）和六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp (αS1?-酪蛋白C端六肽片段）。激活鼠腹膜巨噬细胞需与人乳酪蛋白的三肽（Gly-Leu-Phe）相似的剂量，六肽只要以0.05μm的剂量可达显著活性。另一种六肽Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn（β-酪蛋白的63～68片段）与前述人乳六肽类似，体外虽有激活吞噬作用的活性，然而体内却不能使老鼠免疫受Klebsiella pneumoniae的感染。? 另一类免疫调节肽是血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE）的抑制剂。ACE在催化血管紧张素Ⅱ活化的同时，也可使缓激肽失活，后者能促进巨噬细胞增强淋巴细胞移动与淋巴因子的释放。ACE的抑制剂对缓激肽有利，因此作为免疫刺激物。Marugama等［9］从牛酪蛋白酶解物中分离到的凝血酶原肽（CEI）为ACE的抑制剂，它们分别是CEI12 (αS1?-酪蛋白第13～24氨基酸片段）、CEI5（CEI12的N-末端五肽片段）、CEIβ7（β-酪蛋白第177～183氨基酸片段）和αS1?-酪蛋白C末端六肽片段（TTMPLY），通过对其特性的研究发现，除六肽外，均具有抑制ACE活性的作用。此外，富含脯氨酸的人β-酪蛋白水解物也具有ACE的抑制剂作用。? 从绵羊初乳清中分离出一种富含Pro的多肽（proline-rich polypeptide, Prp）具有免疫调节活性，能促进或抑制免疫反应。从其胰凝乳蛋白酶水解物分离的一种九肽（Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro）及合成的九肽或其C-末端的五肽、六肽均有与Prp相似的免疫调节机能，能诱导休眠B淋巴细胞的生长与分化。? 3 阿片拮抗肽（Opioid antagonist peptides）? 在研究阿片肽的过程中，人们又不断发现某些也具放射受体活性而与阿片肽相拮抗的物质，它们与阿片肽共同存在。Chiba等［10］发现κ-酪蛋白的酶解产物中存在阿片拮抗肽类，并称之为酪新（Casoxins），它们包括Cas　oxinA，CasoxinB和CasoxinC三种类型，其中CasoxinC的拮抗活性最高。CasoxinA是一种七肽（Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asn），与κ-酪蛋白的35～41氨基酸片段相同；CasoxinB是一种四肽（Tyr-Pro-Tyr-Tyr），与牛κ-酪蛋白的58～61和人κ-酪蛋白的31～34氨基酸片段相同；CasoxinC是一种十肽（Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg）与牛κ-酪蛋白的25～34氨基酸片段相同。?由牛乳κ-酪蛋白经胰蛋白酶作用分离得到的CasoxinC除拮抗作用外，尚有抑制血管紧张素转换酶与平滑肌收缩活性；从人乳α??S1?-酪蛋白中得到的CasoxinD（Tyr-Val-Pro-Phe-Pro-Pro-Phe）却未显示抑制血管紧张素转换酶活性。这类肽对治疗因阿片肽活性亢进引起的各种疾病（如休克）特别有效［11］?。? 4 抗高血压肽（Antihypertensive peptides）? 血管紧张素转换酶(AngiotensinⅠ-converting enzyme，ACE)在肾素-血管紧张素系统中对调节血压具有重要的生理功能。肾素作用于血管紧张素原释放出大量非活性的血管紧张素Ⅰ，后者在血管紧张素转换酶的作用下，转变为有活性的血管紧张素Ⅱ，该物质是体内最强的缩血管物质，对血管平滑肌有强烈的收缩作用，直接引起高血压。另一方面又可刺激肾上腺皮质释放醛固酮，增加细胞外液量和血浆量，增加静脉回流量，间接引起高血压。因此，牛乳酪蛋白产生的ACE抑制剂（ACEI）同样可以抑制血管紧张素Ⅱ的产生，对血压进行调节，称为抗高血压肽。? Maruyama［12］报道体外条件下，酪蛋白的胃蛋白水解产物可抑制ACE的活性。后来，从酪蛋白水解产物中分别得到了十二肽（Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-ProGlu-Val-Phe-Gly-Gln），五肽（Phe-Phe-Val-Ala-Pro），六肽（Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp），七肽（Ala-Val-Pro-Tyr-Gln-Gln-Arg），其序列分别同牛αS1-酪蛋白的23～34，23～27，194～199和β-酪蛋白的177～183氨基酸序列相同。饲喂这些多肽可降低自发性高血压鼠的血压，但对心电图、心脏病理组织学和血清脂浓度无影响。? Kohmura等［13］根据人乳酪蛋白序列，从人β-酪蛋白中人工合成69种C末端含有Pro的片段，从κ-酪蛋白中获得23种片段。体外试验表现出对ACE抑制活性的有β-酪蛋白39～52片段、43～52片段和κ-酪蛋白63～65片段，其中β-酪蛋白43～52片段（Ser-Phe-Gln-Pro-Gln-Pro-Leu-Iso-Tyr-Pro）活性最强。从瑞士乳杆菌和酵母菌发酵酸奶中也分离出两种有抑制ACE活性的三肽：Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro。? 5 抗血栓肽（Antithrombotic peptides）? 血凝与凝乳具有相似的生理过程。Jolles等［14］?发现牛乳κ-酪蛋白与人纤维蛋白原γ　链具有结构同源性。纤维蛋白原在体内具有双重作用，它既参与血小板的凝集，又参与纤维蛋白的形成。在血小板的形成过程中，已知血纤维蛋白原上存在两类结合位点：相对专一的血纤维蛋白原γ链C末端序列（His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val）和一类或两类四肽（Arg-Gly-Asp-Ser/Phe，血纤维蛋白原α-链的572～575或95～98片段），这两类肽都能抑制血小板的凝集及血纤维蛋白原结合到ADP活化的血小板上［15］。Jolles发现来源于κ-酪蛋白的106～116残基的十一肽（Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys）可抑制ADP诱导的血小板凝集及其与纤维蛋白原结合的作用，即具有抑制血液凝固及抗血栓形成的作用。由胰蛋白酶水解十一肽所产生的更小肽段（Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys和Asn-Gln-Asp-Lys）活性减弱，不能抑制血纤维蛋白原的结合。? 存在于人乳铁蛋白中的四肽（Lys-Arg-Asp-Ser，39～42片段）与血纤维蛋白原α链中的四肽（Arg-Gly-Asp-Ser）作用相似，也具有抑制ADP诱导的血小板凝集作用，但其作用与蛋白质磷酸化无关，不涉及与GPⅡb-Ⅲa的直接结合。? 6 酪蛋白磷酸肽（Casein phosphopeptides，CPP）〖HS)〗 牛乳酪蛋白是由α?S、β、κ和γ四种类型组成。其中αS和β是高度磷酸化的蛋白质，αS含有8个磷酸丝氨酸基，β含有5个磷酸丝氨酸基，即磷酸基团连接在蛋白质一级结构的丝氨酸位置处。? CPP分布于牛乳蛋白的不同区域,其活性中心是磷酸丝氨酸和谷氨酸簇。经酶解所产生CPP的功能区结构主要有：αS1-(43～58)2P，αS1-(59～79)5P，αS2?-(46～70)4P，β(1～25)4P，β(1～28)4P及β(33～48)4P?［16～18］。由于CPP在中性和碱性pH时，通过磷酸丝氨酸与钙、锌、铁等离子结合，由小肠肠壁细胞吸收后再释放出来，从而有效地避免了钙在小肠中性和偏碱性环境中被沉淀，促进了钙的吸收。 ? 动物实验证明酪蛋白可在活体内生成CPP，当摄入富含酪蛋白的食物后，在小肠食糜中可发现含有大量磷酸丝氨酸残基的CPP，如负离子的磷酸三肽（丝-未知-谷氨酸或丝-未知-磷酸丝氨酸），它们对于实现其生物学功能必不可少。Meiser等［19］在分离β-CM-11阿片肽时，从牛的α-酪蛋白中得到了一个CPP，为α-酪蛋白第66～74氨基酸残基片段（Ser-Ser-Ser-Gln-Gln-Ile-Val-Pro-Asn），其丝氨酸羟基几乎都被磷酸化，它集中了大量的负电荷，可阻止进一步的蛋白水解，并可结合游离的Ca，Fe，Cu，Zn等金属离子形成可溶性盐以增加其在肠腔中的浓度，促进这些离子的被动转运过程。?　　Sato［20］用含有CPP的食物饲喂大鼠，并在食物中加入同位素标记的钙，发现其大腿骨骼中的标记钙明显高于对照组。以后通过对大鼠、小鼠、鸡、猪的试验，都证明CPP具有促进钙、锌、铁吸收的功能［21,22］。Nagai等［23］进一步证实CPP还可促进精子进入卵细胞和体外精卵细胞融合。 7 其它生物活性肽? κ-酪蛋白糖肽（κ-Caseinoglycopeptide）是κ-酪蛋白受凝乳酶或胃蛋白酶作用产生的一种含糖肽，它几乎是消化开始第1小时产生的唯一的肽。有人观察到κ-酪蛋白在新生儿肠道中有促进双歧杆菌生长和抑制大肠杆菌的作用，因而有利于婴幼儿的消化道健康和防止腹泻，而κ-酪蛋白经酶解效果更明显，这种作用与此糖肽有关，甚至在浓度仅有0.5mg/kg时仍具有显著的作用。Stan和Chernikov报道该肽具有抑制大鼠胃酸分泌和胃泌素释放的功能，同时具抑制蛋白酶的活性，因为它同时抑制消化道的流动性。Lahav报道了一种源于牛乳αS1-酪蛋白1～23残基片段的抗菌肽。Fiat证明para-κ-酪蛋白C末端片段是胰凝乳蛋白酶的抑制剂。Azuma等发现人乳β-酪蛋白1～18残基片段（Arg-Glu-Thr-Iso-Glu-Ser-Leu-Ser-Ser-Ser-Gln-Gln-Ser-Iso-Pro-Gln-Tyr-Lys）和105～117残基片段（Gln-Pro-Thr-Iso-Pro-Phe-Phe-Asp-Pro-Gln-Iso-Pro-Lys）具有刺激BALB/C3T3鼠细胞DNA合成的功能［11］。? 8 对乳蛋白生物活性肽研究的展望? 乳蛋白是人们研究活性肽类最为深入的一种蛋白质，这与其蛋白质氨基酸组成相对简单有关。目前对于作为外源性食物的生物活性肽的生理作用和机制还不是完全清楚。乳蛋白生物活性肽的发现可能改变过去对乳蛋白营养功能的单纯评价，提示在评价食物蛋白的生物学价值时须考虑到蛋白质的结构及其在消化道中可能释放出生物活性肽的组成和数量。将来，乳源蛋白可能作为食品添加剂，也可用于药物的生产，也可用于腹泻、矿物质吸收障碍和免疫缺陷的治疗及保健品的生产，发挥其免疫调节、抗血栓、抗菌等功效。目前日本在这方面走在世界前列，以乳蛋白为原料开发的生物活性肽占据了日本市场的主导地位。乳中肽类所具有的生理功能，使其具有很好的应用开发前景。