作者：曹伟, 郝志勇 郗雪艳 孔燕 马驰 崔莲仙 何维【关键词】 ULBP4;,NKG2D;,IFN　　Expression and biological function of ULBP4 in RosettagamiTMB(DE3) and mAb preparation　　[Abstract] AIM: To express human ULBP4 in RosettagamiTMB(DE3) and to prepare monoclonal antibody against ULBP4 for the research of γδT cells recognition mechanism. METHODS: DNA fragments of ULBP4 were derived from HO8910 RNA by reversetranscriptase polymerase chain reaction(RTPCR). The fragments encoding the former 225 amino acids of ULBP4 were cloned into Histag fusion protein expression vector pET22b(+). The CHistag fusion ULBP4(225a) protein was expressed in inclusion body and purified step by step according to manufactory’s protocol and renatured in bag filter. It’s functional effect on NK cells was evaluated by NKG2D binding assay and IFNγ secretion experiments. Prokaryotic expressed human ULBP4 was used as an antigen to prepare monoclonal antibodies by means of the B lymphocyte hybridoma technique. RESULTS: ULBP4 recombinant protein can stimulate NK cells to secrete IFNγ. Through PEG fusion and screening by limited dilution, we obtained four strains of hybridoma cells secreting antiULBP4 antibodies. CONCLUSION: The fusion protein was expressed successfully and functional. At the same time, the antiULBP4 mAbs were prepared successfully. Both of them provide a platform for further research. 　　[Keywords]ULBP4; NKG2D; IFNγ; RosettagamiTMB(DE3) E.coli; Expression; Biological function; monoclonal antibody　　［摘 要］ 目的: 在大肠杆菌中表达ULBP4重组蛋白, 并制备其特异性的单克隆抗体（mAb）, 为γδT细胞对ULBP4的识别机制研究奠定基础。方法: 根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物, 用RTPCR方法从HO8910细胞中扩增得到ULBP4片段, 构建重组原核表达质粒pET22b(+)/ULBP4(前225aa胞外段), 在RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达且主要位于包含体中, 经纯化透析复性后, 分析其对NK细胞IFNγ细胞因子分泌的影响。以ULBP4为抗原, 免疫BALB/c小鼠, 取免疫小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合, 依次经HAT选择培养、 间接ELISA法、 克隆化培养、 荧光免疫检测和流式细胞术以及Western blot筛选和鉴定抗ULBP4 mAb的杂交瘤细胞株。结果: 构建了pET22b(+)/ULBP4(225aa)原核表达体系, 并检测到重组蛋白的有效表达; 纯化的重组蛋白在体外培养体系中可以刺激NK细胞IFNγ细胞因子的分泌。此外, 还获得了4株可稳定分泌抗人ULBP4 mAb的杂交瘤细胞株。结论: 成功地构建并表达了具有生物活性的ULBP4, 为γδT细胞的识别机制研究建立抗原制备平台, 同时所制备的抗人ULBP4 mAb, 为后续研究奠定了基础。　　［关键词］ULBP4; NKG2D; IFNγ; RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌; 表达; 生物学功能; 单克隆抗体　　NKG2D是一种激活性的C型凝集素受体, 由同源二聚体构成, 表达于多种淋巴细胞的表面。近几年, 发现了一种新的NKG2D的配体家族UL16 binding proteins（ULBPs又称为RAET1分子）[1, 2], 其中, ULBP13为糖基磷脂酰肌醇连接的膜蛋白, 而ULBP4和RAET1G则为含跨膜区域和胞内区域的膜蛋白。它们在正常组织细胞表面不表达或表达量很低, 但病毒感染和细胞恶性转化后能明显增强其表达, 暗示了它们在抗感染免疫和肿瘤免疫中潜在的作用。序列分析提示其与MICA较为相似, 且都属于延伸的MHCI类分子家族, 但只含α1和α2功能域且不能呈递小肽。鉴于其序列上与MICA的相似性, 提示其可能也为γδ1T细胞群的抗原之一[3]。事实上, 已有证据表明其中的一个分子ULBP3可以被慢性B型淋巴细胞性白血病患者外周血的γδ1T细胞群所识别[4]。为了进一步加深对γδT细胞识别机制的认识, 我们在原核表达系统中表达并纯化了ULBPs家族的另外一个成员ULBP4, 同时制备其单克隆抗体（mAb）, 为今后的研究工作奠定实验基础。　　1 材料和方法　　1.1 材料 克隆载体pGEMT Easy Vector System购自Promega公司, 原核表达质粒pET22b(+)和宿主菌RosettagamiTMB(DE3) E.coli均购自Novagen公司, DH5α菌为本室保存。HO8910人浆液性卵巢腺癌细胞株、 803人低分化胃腺癌细胞系以及CHO中国仓鼠肾细胞系也为本室保存, 均以含100 mL/L小牛血清的RPMI1640完全培养液进行贴壁培养。而Hep G2人肝癌细胞系则以含100 mL/L小牛血清的MEMNEAA完全培养液进行贴壁培养（HO8910、 803、 Hep G2均为ULBP4 mRNA阳性的细胞株）。NK92细胞由中国科学技术大学生命科学院免疫学研究所田志刚教授惠赠, 以含125mL/L的胎牛血清、 125mL/L的马血清以及200U/mL IL2的MEMα培养液进行悬浮培养。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞为本室保存。细胞培养用RPMI1640购自Gibco BRL公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司, Tag DNA 聚合酶和T4 DNA连接酶购自MBI公司。小量质粒制备试剂盒、 MMV逆转录酶、 Oligo（dT）15 Primer、 RNA酶抑制剂、 Xgal均购自Promega公司。Nde I, Xho I限制性内切酶购自NEB公司。PCR产物切胶回收试剂盒购自TaKaRa公司。HisTrap kit Ni亲和柱购自美国安玛西亚公司。IPTG、 氧化型还原型谷胱苷肽购自MERCK公司。Histag mAb购自北京天为时代公司。HRP和FITC标记的羊抗鼠IgG均购自北京中山公司。Western blot的化学发光底物supersignal West Pico购自Pierce公司。硝酸纤维素膜购自美国安玛西亚公司。NKG2DFc融合蛋白和人IFNγ细胞因子检测试剂盒购自R&D公司。次黄嘌呤（H）、 氨基喋呤（A）、 胸腺嘧啶（T）、 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂以及PEG4000购自Sigma公司。BALB/c近交系小鼠（8周龄, 雌性）, 购自中国药品和生物制品鉴定所啮齿类实验动物中心。1.2 方法　　1.2.1 ULBP4全长cDNA的扩增和克隆 根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物, 于编码的5′和3′端各设计一条引物P1、 P2, 同时设计编码前225个氨基酸的下游引物P3, 以上引物均由北京奥科生物技术有限公司合成: P1: 5′ GGAATTCCATATGCGAAGAATATCCCTGACTT 3′; P2: 5′ CCGCTCGAGAGACGTCCTCAAGGGCCAGA 3′; P3: 5′ CCGCTCGAGATCTGGTAGACTAGAAGAAGACC 3′。其中, 斜体代表添加的酶切位点（Nde I和Xho I）和保护碱基。按照Trizol试剂盒的说明书提取RNA同时进行逆转录, 以cDNA为模板, 扩增全长的ULBP4基因片断, 上游引物为P1, 下游引物为P2。扩增条件为: 94℃ 30 s, 60℃ 45 s, 72℃ 90 s, 共进行30个循环, 最后72℃再延伸10 min。扩增出的片段用T4 DNA连接酶克隆入载体pGEMT Easy Vector System, 用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α, 用Xgal和IPTG进行蓝白斑筛选, 阳性重组子经菌液PCR和测序分析证实（由上海博亚生物技术有限公司完成）。同时使用小量质粒制备试剂盒提取测序正确的阳性质粒。　　1.2.2 ULBP4(225aa)原核表达质粒pET22b(+)的构建和诱导表达 以测序正确的阳性质粒为模板, P1和P3引物对扩增ULBP4(225aa)片段, PCR产物经切胶纯化回收后, 使用Nde I、 Xho I限制性内切酶直接双酶切, 37℃过夜。将双酶切的产物纯化回收后连入原核表达载体pET22b(+)同时转化大肠杆菌DH5α, 氨苄抗性的阳性重组子经菌液PCR和测序分析证实与预期结果相符（由上海博亚生物技术有限公司完成）。测序正确的原核表达载体pET22b(+)/ULBP4(225aa)质粒转化RosettagamiTMB(DE3) E.coli, 挑取克隆菌接种于50 mL LB培养液中（氨苄青霉素 100 μg/mL）, 37℃振荡培养过夜。次日以1∶100的比列转接于1L2×YT培养液中, 37℃振荡培养, 当A600值达到06~08时加入IPTG（至终浓度为05 mmol/L）进行诱导, 37℃振荡继续培养4 h。　　1.2.3 ULBP4的分离纯化和复性 离心收集菌体, 经超声破碎后高速离心获得包含体, 3 mol/L尿素反复洗涤后溶于8 mol/L的尿素中。按照安玛西亚公司的说明书过柱纯化ULBP4。收集纯化的样品进行SDSPAGE电泳以及Western blot检测。将纯化后的样品装入透析袋中, 梯度降低尿素的浓度同时在尿素浓度为2 mol/L时补加氧化型还原型谷胱苷肽, 最后换成PBS并透析3次。　　1.2.4 ULBP4的生物学功能鉴定 (1)以1 μg/孔的人NKG2D重组蛋白包被96孔板, 4℃过夜, 以含5mL/LTween20的PBS洗涤3次, 用20 g/L BSA于37℃封闭1 h, 洗涤3次后分别加入ULBP4以及带His标签的无关蛋白, 37℃孵育1 h, PBST洗涤3次后加入抗Histag的mAb, 37℃孵育1 h, PBST洗涤3次后加入HRP酶标羊抗鼠二抗, 37℃孵育1 h, 再次以PBST洗涤5次, 并用重蒸水洗涤3次。OPD底物显色系统显色5～10 min, 测定A490/630值。(2)以10 μg/孔包被24孔板, 离心收集NK92细胞, 调整细胞密度为5×105/孔, 37℃培养24 h后收集上清, 用R&D公司的人IFNγ检测试剂盒分析培养上清中的含量。　　1.2.5 抗ULBP4 mAb的制备 取50 μg的ULBP4原核表达蛋白和弗氏完全佐剂混合后皮下多点注射小鼠, 然后分别在第14天, 21天, 28天使用同剂量的抗原和弗氏不完全佐剂混合后皮下多点注射小鼠。融合前3 d, 尾静脉加强注射1次。取免疫小鼠的脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG的作用下融合, 在HAT选择性培养基中进行筛选, 并经有限稀释克隆化培养获得杂交瘤细胞株。　　1.2.6 抗ULBP4 mAb的特性鉴定 (1)间接ELISA法检测抗体: 以1 μg/孔ULBP4抗原包被96孔板, 并设立空白、 阴阳对照, 37℃包被过夜。以含5 mL/L Tween20的PBS洗涤5次, 并用含20 g/L BSA的PBS于37℃下封闭2 h, 再次以含5 mL/L Tween20的PBS洗涤5次。加入待测的细胞培养上清, 37℃孵育1 h, 以含5 mL/L Tween20的PBS洗涤5次。加入HRP酶标羊抗鼠二抗, 37℃孵育1 h, 以含5 mL/L Tween20的PBS洗涤5次,并用重蒸水洗涤3次。OPD底物显色系统显色5~10 min, 测定A490/630值。(2)间接免疫荧光法检测抗体: 分别将803、 Hep2、 Hep G2、 CHO细胞和稳定表达ULBP4的CHO细胞接种24孔板, 37℃培养48 h后, PBS洗涤5次, 用40 g/L多聚甲醛冰上固定30 min。以含50 g/L BSA的PBS于4℃封闭过夜。次日, PBS洗涤5次后加入待测样品, 37℃孵育1 h, 以PBS洗涤5次。加入FITC酶标羊抗鼠二抗, 37℃孵育30 min, 以PBS洗涤5次, 并用重蒸水洗涤3次。于荧光显微镜下检测。(3)流式细胞术分析: 收集待测细胞, PBS洗3次, 吸尽上清, 于每管分别加入抗ULBP4 mAb, 4℃, 孵育60 min。离心, PBS洗3次, 加入FITC酶标羊抗鼠二抗, 4℃, 孵育60 min。离心, PBS洗3次, 加入500 μL PBS固定液, 4℃保存, 进行流式细胞术常规荧光分析。　　2 结果　　2.1 重组表达载体的构建以及鉴定 首先采用RTPCR方法从HO8910细胞中扩增出ULBP4全长基因, 测序结果证实所扩增的基因完全正确。然后再以P1和P3引物扩增出ULBP4的胞外段（225aa）, PCR产物大小分别为:ULBP4全长808 bp、 ULBP4胞外段694 bp（片段大小均包含酶切位点和保护碱基序列）, 见图1。用Nde I和Xho I限制性内切酶将ULBP4胞外段克隆入原核表达载体pET22b(+)。将连接产物转化大肠杆菌DH5α, 抗生素筛选后的阳性克隆经菌液PCR鉴定, 取其中的阳性克隆进行测序。根据序列比较, pET22b(+)中插入片段的序列与GenBank中的序列一致。重组质粒载体的双酶切鉴定见图2。　　图1 ULBP4全长和ULBP4胞外段PCR结果（略）　　Fig 1 The PCR products of ULBP4 and the outer part segment　　1: ULBP4; 2: The outer part segment of ULBP4; 3: DNA marker.　　图2 pET22b(+)/ULBP4(225aa)原核表达重组质粒的双酶切鉴定（略）　　Fig 2 Identification of recombinant vector pET22b(+)/ULBP4(225aa) digested by Nde I and Xho I 　　1: Recombinant vector pET22b(+)/ULBP4(225aa) digested by Nde I and Xho I; 2: DNA marker.　　2.2 ULBP4蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和分离纯化 ULBP4蛋白的原核表达系统在05 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4 h, 表达以包含体为主, 相对分子质量（Mr）约为25000。镍柱纯化后目的蛋白经SDSPAGE电泳和Western blot证实Mr在31000左右有一蛋白带, 与预期大小相符（图3）。　　图3 大肠杆菌诱导后的SDSPAGE电泳(A)及ULBP4的Western blot(B、 C)结果（略）　　Fig 3 SDSPAGE (A) and western blot analysis (B and C) of ULBP4 expressed in RosettagamiTMB(DE3)　　(A) 1: Uninduced supernant of cell lysate by sonication; 2: Induced supernant of cell lysate by sonication; 3: Uninduced precipitate of cell lysate by sonication; 4: Induced inclusion body of cell lysate by sonication; 5: Purified ULBP4 protein; M: Low molecular marker proteins. (B) 1: ULBP4 detected with AntiHistag mAb; M: Low molecular marker proteins. (C) 1: ULBP4 detected with AntiULBP4 mAb 10F7; M: Low molecular marker proteins.　　2.3 体外NKG2D结合实验和细胞因子分泌实验 间接ELISA检测结果显示: 原核表达复性后的ULBP4能与人NKG2D结合, 而带His标签的无关蛋白则不能与之结合, 说明复性后的ULBP4仍能维持正确的天然构像。此外, 细胞因子分泌实验显示: 虽然NK92细胞有一定的本底表达, 但经ULBP4刺激后NK92细胞的IFNγ分泌明显增强。　　图4 ULBP4刺激NK92细胞分泌IFNγ（略）　　Fig 4 ULBP4 stimulated NK92 cells to secrete IFNγ　　2.4 杂交瘤细胞株的建立 通过细胞融合、 筛选以及克隆化培养, 获得了4株可稳定分泌高效价mAb的杂交瘤细胞株6C12、 8C9、 8G1及10F7。　　2.5 抗人ULBP4 mAb的特性鉴定 荧光免疫检测和流式细胞术结果显示以上4株杂交瘤细胞株所分泌的mAb能识别天然的ULBP4。部分结果见图5和图6。　　图5 抗ULBP4 mAb的荧光免疫技术检测（略）　　Fig 5 Immunofluorescence assay of the characterization of antiULBP4 mAbs　　A: CHO cells stained with antiULBP4 mAb 8C9; B: ULBP4CHO cells stained with antiULBP4 mAb 8C9; C: HO8910 cells stained with antiULBP4 mAb 8C9; D: HO8910 cells stained with antiULBP4 mAb 6C12.　　图6 抗ULBP4 mAb的流式细胞术分析（略）　　Fig 6 Flow cytometry assay of the characterization of antiULBP4 mAbs　　3 讨论　　γδT细胞作为第3种特异的免疫细胞, 虽然在人体T细胞群体中只占很少的比例, 但在抗感染免疫、 免疫监视、 免疫调节以及专职的抗原提呈方面都起重要的作用[5, 6]。最近一项相关的研究表明慢性B型淋巴细胞性白血病患者外周血的γδ1T细胞群可以识别ULBP3[4], 然而遗憾的是未能对ULBP家族的其他成员进行相关的研究。为此, 我们在原核系统中表达了ULBP4, 所表达的ULBP4可刺激NK92细胞分泌IFNγ, 表明包含体表达复性后的蛋白仍有活性, 为进一步研究γδ1TCR对ULBP的识别机制奠定了基础。值得注意的是, 在进行原核表达的过程中首先使用的是传统的BL21(DE3)表达菌, 但是未能获得表达。而后我们从Novagen公司引进RosettagamiTMB(DE3)表达菌, 该菌本身有3种抗性（氯霉素、 卡那霉素和四环素）, 可以提供稀有碱基, 在05 mmol/L IPTG诱导下获得了高效表达。此外, 2006年有报道在淋巴细胞白血病患者的外周血中能检测到游离性的ULBP2, 而在健康人中则检测不到, 这一过程是由金属蛋白酶所介导的, 表明了其在肿瘤逃逸中潜在的作用[7]。除此以外, RAET1G在RNA水平发生选择性的剪切也能生成无跨膜区和胞内区的游离性的ULBP。因此, 我们所制备的ULBP4 mAb还为ULBP4所介导的肿瘤逃逸机制研究奠定了基础。　　参考文献:　　[1] Bacon L, Eagle RA, Meyer M, et al. 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