摘 要：对丝状真菌YW－7和乳酸菌混合发酵豆粕进行了研究。浅盘培养的最佳工艺条件为：料水比1：0.8，YW－7接种量2%，乳酸菌接种量1.5%，料层厚度控制在2-3cm，30℃好氧发酵24h后转为厌氧发酵48h，70℃烘干后产品平均粗蛋白含量大于53%，肽含量为23%，总酸含量2.5%，pH值4.4，对豆粕中的抗营养因子水苏糖和棉子糖具有显著的去除效果，有望成为一种良好的蛋白饲料。关键词：丝状真菌；乳酸菌；发酵豆粕；蛋白饲料我国是一个农业大国，养殖业连续20年来以9%以上的高速度增长，畜牧主产区的饲料资源短缺问题越来越严重，尤其是蛋白质饲料[1]资源缺口逐年加大。鱼粉作为在畜牧业上经常使用的优质蛋白原料，受海洋资源的限制性影响，价格连续多年持续攀升。因此鱼粉替代品的研究成为了紧迫的全球性课题。 1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株丝状真菌YW－7、乳酸菌均为本实验室保藏，其中YW－7分自泰国原始森林。1.1.2 材料与试剂 豆粕：购自无锡高天饲料厂，粉碎，过40目筛。麸皮购自无锡高天饲料厂。其它试剂均为分析纯。1.1.3 培养基1.1.3.1 PDA斜面培养基 马铃薯200g切块，加水1000mL，80℃煮沸1h，过滤，滤液加葡萄糖20g，琼脂20g，补足水至1000mL，pH自然。1.1.3.2 MRS斜面培养基（植物乳杆菌用） 蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温－80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL，pH值6.2～6.6。1.1.3.3 YW－7固体种子培养基 麸皮10g，水10mL，混匀。1.1.3.4 MRS液体种子培养基（培养植物乳杆菌用） 配方同1.1.3.2，其中去掉琼脂。1.1.4 主要仪器、设备 电子天平、干燥箱、恒温培养箱、凯式定氮仪、超净工作台、20×30cm浅盘、sigma－POK色谱柱。1.2 方法1.2.1 培养方法 称取定量豆粕，按不同料水比加入水搅匀，高压灭菌。再称取不同比例的丝状真菌YW－7固体种子和乳酸菌液体种子与培养基混匀，30℃于浅盘培养，好氧发酵一定时间再转为厌氧发酵一定时间。1.2.2 测定方法1.2.2.1 粗蛋白的测定 参照GB/T6432-1994。1.2.2.2 肽含量的测定[5] 称取 2.00g 烘后样品，加入 15%TCA（三氯乙酸）溶液15mL，混合均匀，静置10分钟。将溶液定量转移，在4000转/分钟下离心10分钟后，取全部上清液作为制得的样品溶液。将其全部加入硝化瓶中，采用凯式定氮法测定蛋白含量。溶液中蛋白占样品总粗蛋白含量的百分比即为样品的肽含量。1.2.2.3 总酸量的测定 参照GB/T12456-1990。1.2.2.4 pH的测定 称取5.00g烘后样品，加入50mL 蒸馏水，混合均匀。磁力搅拌10min，将溶液定量转移至离心机，3000转/分钟离心10分钟后，取上清液作为试样。采用pH检测仪测定样品的pH值。1.2.2.5 水苏糖、棉子糖含量的测定 色普条件：色谱柱：sigma－POK，6.5×300mm；流动相：纯水；流速：0.4mL/min；柱温：85℃；检测器：示差折光检测仪。样品处理：取200～300mg样品，加3ml蒸馏水，溶解后再加7ml无水乙醇，即为上柱样品，进样量20ｕL。2. 结果与分析2.1 发酵方式的确定YW－7培养属于好氧发酵，乳酸菌培养属于厌氧发酵，若用两种菌共同发酵豆粕必须有一个好氧加厌氧的过程。本文实验了两种发酵方式，方式1：先接种YW－7，发酵24h，再接种乳酸菌发酵72h；方式2：两菌按适当比例同时接种，先好氧发酵24h再转为厌氧发酵72h。结果见表1。两种发酵方式并没有太大区别，从操作难易来看，显然方式2更加简单，因此我们采用共同接种，先好氧再厌氧的发酵方式。表1 发酵方式发酵方式 方式1 方式2粗蛋白含量 54.14% 55.48%肽含量 24.71% 23.16%总酸 2.45 2.64pH 4.25 4.432.2 料水比的影响 料水比是固体发酵中一个十分重要的参数，微生物的生长、产物的代谢以及酶的作用都离不开水。水分含量太少影响发酵效果，太多又会使料发粘结块，不仅阻遏氧的传递，也会加大后继烘干的能耗。预实验发现当料水比低于1：0.6时，YW－7萌发时间明显滞后，且长势较弱。高于1：1时，豆粕有结块现象。故选择1：0.6、1：0.8、1：1进行实验。图1显示粗蛋白及肽含量随料水比的增加而增加，pH值减小。但1：0.8和1：1相差并不大，故选取1：0.8为合适料水比。图1 料水比的影响2.2 不同菌种接种量对发酵的影响由于发酵第一阶段属于好氧发酵，主要是YW－7的充分生长，但乳酸菌在好氧阶段同样有不同程度的增殖，其产酸，降低pH的作用可以抑制霉菌生长。因此我们在确定YW－7接种量的基础上再考察乳酸菌的接种量。接种量分别选取了1%、2%、4%、6%，乳酸菌为1%，发酵过程为方式2。实验结果如表2所示。表2 YW－7接种量的影响接种量1%2%4%6%霉菌生长情况+ + + + ++ + ++ + +粗蛋白含量51.35% 53.34% 53.65% 55.67%肽含量18.39%23.03%22.42%23.16%可以看到接种量超过2%以后，无论生长情况和粗蛋白、肽含量增加均不明显，最终确定霉菌的接种量为2%。在此基础上分别取0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的乳酸菌接种量进行试验。乳酸菌厌氧发酵阶段主要是总酸量的积累，总酸量基本上可以通过pH反映。因此我们以pH值为考察指标，结果见图2。实验中我们发现乳酸菌接种量为2.0%时，YW－7生长时间有所延后，可能是乳酸菌对其产生了一定的抑制作用，最终选择1.5%为乳酸菌最适接种量。图2 不同乳酸菌接种量的pH变化曲线2.3 发酵时间的确定采用两步发酵方式，每一步发酵时间都显得尤为重要。既要考虑到菌体的充分生长代谢，又要考虑发酵周期的长短。由图2已经知道厌氧48h后，pH值基本不再增加，因此我们以粗蛋白及肽含量为考察指标进行试验，由于YW－7发酵24h后有孢子开始产生，孢子对动物肠道具有刺激作用，因此将好氧阶段控制在24h。两个指标变化曲线如图3所示。24h后粗蛋白含量趋于平衡，72h后肽含量趋于平衡。粗蛋白含量的增加主要集中在好氧阶段，这一阶段，YW－7的生长非常旺盛，一方面可将豆粕中的一部分纤维素、淀粉等物质吸收消耗掉，另一方面还可转化成菌体蛋白，都在一定程度上增加了产品的粗蛋白含量。而肽含量的增加集中在24－72h之间，这应该是好氧阶段YW－7产生的蛋白酶及厌氧阶段乳酸菌产生的蛋白酶共同作用的结果。图3 发酵时间的影响2.4 料层厚度的影响料层厚度主要影响好氧发酵阶段，涉及到三个方面：通气量多少、水分蒸发快慢以及将来应用于生产中占地面积的大小。料层太薄，水分蒸发过快以及料层太厚，通气不良都会影响菌体的生长。实验选取1、2、3、4cm厚度，发酵24h后，粗蛋白含量情况如图4所示。料层为1cm时，观察到的现象是豆粕发散，发干，只有稀少的白色菌丝萌发；而厚度为2cm和3cm时，豆粕均已结块，掰开可以看到密密麻麻的细小菌丝；4cm时，中间部分的菌丝较上下表层少，生长不充分。菌丝生长情况基本反映粗蛋白的含量。因此浅盘培养可以将厚度控制在2－3cm之间。图4 料层厚度的影响2.5 最佳工艺条件下低聚糖的去除效果 豆粕中含有多种抗营养因子，其中胰蛋白酶抑制剂、血球凝聚素及脲酶等热敏感类物质经过烘干加工，可以一定程度上降低其含量，达到钝化效果。而一些热不敏感类物质，包括非淀粉多糖、大豆抗原蛋白、低聚糖及植酸等不能通过加热的方式去除[6][7]。微生物生长过程中产生的酶类或许具有潜在的降解此类物质的能力。我们对低聚糖类物质中的水苏糖和绵子糖进行了考察，结果见图5。通过YW－7、乳酸菌单独培养及共培养实验发现，两种菌对上述低聚糖均有降解作用，而两菌共培养时对低聚糖的降解效果明显好于单独培养，几乎达到了完全去除的效果。 （a） （b） （c）（d）（a）豆粕对照样 （b）丝状真菌YW－7发酵样 （c）乳酸菌发酵样 （d）、丝状真菌YW－7乳酸菌共培养发酵样Ⅰ 水苏糖 Ⅱ棉子糖图5 不同样品低聚糖含量色谱图3. 结论通过固体发酵实验，确定了浅盘培养时，YW－7和乳酸菌共同发酵豆粕的各项最佳参数，其中料水比为1：0.8，YW－7接种量为2%，乳酸菌接种量为1.5%，料层厚度控制在2-3cm，发酵采用先好氧后厌氧的方式，其中好氧阶段为24h，厌氧阶段为48h。产品平均粗蛋白含量维持在53%，肽含量维持在23%，总酸含量为2.5%，pH值4.4。通过发酵，豆粕中的低聚糖类抗营养因子水苏糖和棉子糖得到了彻底的去除。由于上述研究均在实验室完成，对于将来车间大规模生产时的工艺参数仍需摸索，另外对豆粕的非淀粉多糖、大豆抗原蛋白等抗营养因子以及肽分子量的大小还未涉及到，这些都需要以后进一步的研究。 参考文献[1] 郭维烈. 新型发酵蛋白饲料. 北京：科学技术文献出版社，1995[2] Kee-Jong Hong, Chan-Ho Lee, and Sung Woo Kim. Aspergillus oryzae GB-107Fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybeanmeals.J Med Food, 2004, 7(4):430-436[3] 冯克宽, 王明谊. 利用木霉和酵母混合发酵提高纤维索物质蛋白质含量. 西北师范大学学报, 1998,34(4): 67-69[4] 蔡皓. 多菌种发酵生物活性蛋白饲料的发酵研究. 粮食与饲料工业,2000,06: 32-34[5] 张翠凤, 李小东, 郝再彬,等. 大豆肽的快速测定方法. 中国乳品工业,2004(8):38-40[6] 刘波, 章世元, 姜德兴, 等. 饲料中的抗营养因子及处理方法.粮食与饲料工业,2003(2):19-21[7] 吕刚, 张克英. 豆粕中的抗营养因子及钝化方法. 西部饲料, 2007(10):16-20