山东轻工业学院食品与生物工程学院/卫琳 宋俊梅 宁维颖摘 要 该文对米曲霉固态发酵豆粕生产大豆肽的条件进行了研究。结果表明，最适的发酵原料（由豆粕和麸皮组成）中豆粕含量为93%，发酵温度35℃，初始pH为6.8，发酵时间102h。在此条件下，发酵得到的大豆肽转化率达62.77%。关键词：固态发酵；米曲霉；大豆肽；转化率大豆肽即大豆蛋白质经过控制性的水解、精制以后得到的一类活性肽，通常是由3~6个氨基酸组成的低分子量肽。现代研究发现许多小分子量肽在经人体消化道时不被水解，可直接被人体吸收利用，具有降血压和降胆固醇的功能，能使机体疲劳和肌肉酸感迅速消失，身体感到轻松，肌肉变得结实有力。不仅如此，大豆肽溶液还具有良好的加工性能，尤其是大豆肽在大豆蛋白的等电点pH4.3附近保持溶解状态[1]。这一酸溶特性为开发酸性大豆饮料和食品提供了条件。常用的制备方法是酶解法，但利用酶解方法产生的大豆肽具有难以脱除的苦味。米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等[2]。在淀粉酶的作用下，在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质切成数段的小分子，即成为大豆肽，将大豆肽利用酸溶特性提取出来，发现苦味降低，同时伴有酯香味。豆粕是大豆榨油后的副产物，其蛋白质含量高达加40%~50%，并且还有丰富的碳水化合物和矿物质。随着人们对大豆肽功能特性和营养价值的认识的加深，越来越多的专家开始研究发酵法生产大豆肽，近年来有些学者用固态发酵生产蛋白饲料。但米曲霉固态发酵法生产大豆肽的研究未见报道。本文对米曲霉固态发酵法生产大豆肽的广泛应用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与设备1.1.1 材料 米曲霉A-9005，山东大学微生物实验室提供。豆粕，山东万得福集团生产。1.1.2 培养基 斜面培养基：米曲霉A-9005查氏培养基[3]；液体活化培养基：米曲霉A-9005查氏培养基[3]；发酵培养基及其发酵：按65%含水量配制发酵基质。配制不同豆粕与麸皮比和pH值（5.4～7.0）的条件下的豆粕，取28g分装于250mL三角瓶中，121℃，20min灭菌，待用。冷却接种，按10%接种，于不同温度下进行发酵。1.1.3 试剂 浓硫酸，双氧水，五水硫酸铜，硫酸钾，硒粉，硼酸，溴甲酚绿，甲基红，盐酸，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。1.1.4 仪器设备 上海天平仪器厂FA2004分析天平；东联电子HZQ-Q振荡器；北京医用LG10-2.4高速离心机；苏州净化SW-CJ-2G型双人净化工作台；上海申安DSX-280AI型不锈钢手提式灭菌锅；FOSS分析公司全自动凯氏定氮仪；上海精宏MJPS-150型霉菌培养箱。1.2 试验方法1.2.1 工艺流程 原料（主要为豆粕）?固态发酵?三氯乙酸提取?大豆肽提取液。将接菌后的发酵培养基放入相对湿度90%霉菌培养箱不同温度下培养。固体发酵：取一定量的豆粕，按不同比例加入麸皮，调pH至5.4～7.0，发酵料坯含水率调节至65％。经灭菌、冷却，用米曲霉A-9005接种，选择不同的发酵温度，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。1.2.2 提取及计算方法 称取5g样品（精确至0.0001g），加入5mL10%三氯乙酸溶液，混合均匀，再加入10mL 5%三氯乙酸溶液，静置沉降5min后转到离心管中，在4000rpm下离心10min，取上清液并转到25mL比色管中定容[4]。酸溶蛋白测定：按GB／T 5009.5-2003操作[5]。大豆肽转化率（%）= 酸溶蛋白含量/原豆粕蛋白含量2 结果与讨论2.1 发酵时间的确定按1.1.2方法，在90%豆粕含量、10％接种量、pH6.0、30℃培养条件下进行发酵，测定不同发酵时间时样品的酸溶蛋白含量并按1.2.3方法将其转化成转化率，结果见图1。从图1可知发酵过程中大豆肽转化率随发酵时间增加而增加，在120h以后略有下降，在发酵96h后大豆肽转化率增加速率开始放慢，在120h达到最高点48.61％，从生产角度考虑，发酵时间定在96h，此时的大豆肽转化率达47.78％。图1米曲霉发酵过程转化率的变化2.2 不同豆粕含量对转化率的影响在2.1的基础上，分别考察原料中豆粕含量为86％、89％、94％和纯豆粕对转化率的影响，结果见图2。从图2可知豆粕含量在90％左右大豆肽转化率较高，可以到达53％左右图1米曲霉发酵过程转化率的变化2.2 不同豆粕含量对转化率的影响在2.1的基础上，分别考察原料中豆粕含量为86％、89％、94％和纯豆粕对转化率的影响，结果见图2。从图2可知豆粕含量在90％左右大豆肽转化率较高，可以到达53％左右。图2 原料中不同豆粕含量对转化率的影响2.2 pH值对转化率的影响在前述实验的基础上，分别考查pH5.4、5.8、6.2、6.6、7.0等5个发酵培养基对转化率的影响，结果见图3。从图3可知随着pH的升高大豆肽转化率是先升高后降低，pH6.6时转化率最高达53.87％。图3 不同pH对米曲霉转化率的影响2.2 不同发酵温度对转化率的影响一般在工农业应用中的绝大多数微生物属于中温性微生物，其最适生长温度为25-35℃。但是生长速度高并不等于发酵速度快，更不等于代谢产物积累量大。因此，在实际生产中必须针对要求来确定培养温度。本实验采用25、28、31和34、37℃5个温度作发酵温度分别发酵，其他条件同2.3。结果如图4，从图4可知34℃时转化率最高，大约为58％。图4 不同温度对米曲霉转化率的影响2.5 工艺优化根据上面单因素实验，对原料中豆粕含量、pH、发酵温度和发酵时间进行L9（34）正交试验，因素与水平见表1，试验结果见表2。表1 正交试验因素与水平表A(原料中豆粕含量（%）)B( pH)C(温度（℃）)D(发酵时间（h）)876.43190906.63396936.835102表2 正交试验结果试验号ABCD转化率（%）1111143.402122248.653133356.184212354.255223241.286231150.407313258.528321361.049332152.30К149.3852.0651.6148.70К248.6450.2951.7049.45К357.2052.9652.1757.28R8.562.670.568.58由表2可以看出，A3B3C3D3为实验的最佳组合，即：发酵料坯中豆粕含量为93％，pH为6.8，发酵温度为35℃，发酵102 h。其中豆粕含量和发酵时间的影响最大，其次是pH和温度。对最佳组合进行双组平行试验得转化率为62.77%。先前研究的黑曲霉AS3.350固态发酵豆粕生产大豆肽的工艺条件为发酵料坯中原料（由豆粕和麸皮组成）中豆粕含量87％、pH5.8、发酵温度30℃，发酵时间90h。在此条件下发酵豆粕中酸溶蛋白含量为62.35％。可知黑曲霉和米曲霉发酵得大豆肽转化率相差不大，米曲霉的发酵条件比黑曲霉高，发酵时间长，成本较高，但是米曲霉发酵香味较浓。3 结论用米曲霉A-9005固态发酵豆粕生产大豆肽的工艺条件为：发酵料坯中原料（由豆粕和麸皮组成）中豆粕含量为93％、pH6.8、发酵温度为35℃，发酵时间为102h。在此条件下发酵豆粕中酸溶蛋白含量为62.37％。（参考文献略）