江西省农业科学院畜牧兽医研究所/张吉鹍 刘林秀 邹志恒 储怡士江西核工业天地和药业有限公司/李龙瑞摘 要：该文介绍了生物发酵法高效制备大豆多肽饲料复合菌种的筛选及其发酵工艺、大豆多肽饲料在动物日粮配方中的地位与作用及其营养功能。关键词：发酵；大豆多肽；菌种；选育小肽与氨基酸具有相互独立的吸收、转运机制，小肽的吸收耗能底、不易饱和且不同的肽之间转运无竞争性与抑制性，同时小肽本身对肽和氨基酸的转运具有促进作用，动物对小肽的吸收比氨基酸更迅速、更有效。此外，小肽在加强动物机体的免疫功能、促进组织蛋白质的沉积与提高动物的生产性能上都比游离氨基酸的效率高。以这一先进理论为指导，江西省农业科学院与江西核工业天地和药业有限公司应用生物发酵技术降解大豆蛋白，生产出功能大豆多肽饲料。制备功能大豆多肽饲料的工艺目标是：一方面培养微生物产生非淀粉多糖（NSP）酶，淀粉酶，糖化酶等消化酶，破坏植物细胞壁以提高消化率和分解利用导致幼龄动物肠道病原微生物生长的不良寡糖、大豆凝集素、非淀粉多糖、胰蛋白酶抑制因子与大豆抗原等抗营养因子，对豆粕进行“解毒”；另一方面培养微生物产生蛋白酶，降低豆粕蛋白的大分子丰度，产生多肽（含寡肽）。同时采用低温脉冲干燥工艺保留产品中益生菌、消化酶、乳酸和多种生物活性因子。现就生物发酵法生产大豆多肽的菌种选育及其发酵工艺与大豆多肽饲料的应用前景作一概述。1 生物发酵法高效制备大豆多肽菌种的选育1.1 菌种的筛选及其优化组合初步挑选的菌种再经过富集培养基的多次复选、多种不同分离培养基（如粗筛产纤维素酶菌株分离培养基与初筛产蛋白酶菌株分离培养基等）、斜面培养基的筛选以及发酵基础培养基的豆粕发酵试验，定向筛选出复合菌系。该复合菌系组成为乳酸菌、枯草芽孢杆菌、粪链球菌、黑曲霉与酵母菌。乳酸菌为乳酸球菌与植物乳酸菌，前者筛选自酸奶，后者筛选自青贮饲料堆，用途为生产乳酸。枯草芽孢杆菌筛选自猪粪堆，作为益生菌和生产外切蛋白酶。粪链球菌筛选自动物肠道，作为益生菌同时生产乳酸。黑曲霉筛选自橘子皮，生产果胶酶，纤维素酶、内切蛋白酶。酵母筛选自豆制品厂的污泥，与黑曲霉协同作用，利用黑曲霉的分解产物，同时作为益生菌。所筛选出的菌种，再经多代分离纯化，然后接种发酵豆粕。1.2 生物发酵生产大豆多肽工艺参数的优化工艺参数的优化是生物发酵生产大豆多肽技术的关键环节之一。发酵工艺参数主要包括发酵时间、pH值、发酵温度、菌液接种量、底物水分含量、底物组分比例等，不同的微生物有其特定的适宜发酵条件。本研究采用一次发酵设置一个变量的试验技术，对生物发酵生产大豆多肽工艺参数予以优化。经研究，得出了对多菌种组合发酵条件下的工艺参数，并就多菌种组合生物发酵生产大豆多肽技术的工业化进行了研究，适合产业化开发。1.2.1 发酵时间 发酵时间是多菌种组合对豆粕发酵的主要参数，也是影响发酵效果的重要因素，其长短取决于发酵所产微生物的数量、微生物本身的特性及微生物所分泌酶的酶解效率。发酵时间短，则发酵不彻底，效果差，不能去除豆粕中的抗营养因子及生成足量的多肽。发酵时间过长，则营养损失大，主要是由于微生物自身新陈代谢，需要消耗营养物质，特别是碳水化合物。本研究结果表明，多菌种组合发酵生产大豆多肽的适宜时间为48 h。1.2.2 pH值 产纤维素酶菌种适宜在中性环境中生活，所分泌的纤维素酶活性最高，产果胶酶、蛋白酶菌种较适应在偏酸性环境中生活，但混合菌种在pH6.0～8.0范围内生长良好，所分泌的酶系，其活力未受到酸碱环境的影响，复合菌种发酵基础培养基的适宜pH为6.0～8.0。1.2.3 发酵温度 试验中发现，在35℃～40℃时，微生物所分泌的纤维素酶和果胶酶活性最高，但不利于蛋白酶的分泌。在20℃～25℃的温度范围内，微生物所分泌的蛋白酶的量多，但菌种生长缓慢，且微生物的“解毒”效果差。实验证明，开始培养时温度设定在30±1℃，24 h后培养温度设定为28±1℃能获得好的“解毒”效果与高的大豆多肽生产效率。1.2.4 菌液接种量给底物提供适宜的接种量对生物发酵生产大豆多肽饲料具有重要意义。接种量低，则微生物在规定时间内生长量不足，相关酶系的分泌不足。接种量过高，则微生物生长过度，导致相关酶系的分泌的抑制。本研究发现，菌液接种量为5%（v/w），“解毒”与大豆蛋白水解效果最好。1.2.5 底物水分含量实验中发现，含水量在1:0.6～1:0.9（底物:水）范围时，含水量高不利于微生物纤维素酶的分泌，而有利于微生物淀粉酶、蛋白酶的分泌。但若底物含水量大于1:0.9时，则培养基板结，减少底物的通透性，从而限制了氧气的传递，不利于菌丝体的生长。但若底物含水量小于1:0.6，发酵底物营养物的溶解度与底物颗粒的膨胀程度均降低，从而影响发酵效果。在含水量为1:0.7时，大豆蛋白水解效果最好。1.2.6 底物组成豆粕中含有较高的粗蛋白，可发酵糖类物质含量较少，影响发酵效果。因而，在底物中添加一定量的可发酵碳水化合物，如小麦麸、玉米粉等物质，有利于提高发酵效率。在试验中，曾分别以豆腐渣、玉米粉、玉米干酒糟、醋渣替代基础培养基中的麸皮，发现产酶效果都不如麸皮。可能是麸皮中的粗纤维对纤维素酶及果胶酶有一定的诱导作用，且麸皮“膨松”，提高通透性，更有利于菌丝体生长。同时发现小量的玉米粉能促进菌体的生长，并能刺激淀粉酶的形成。最终确定复合发酵底物的适宜组成比例为豆粕70%、麸皮27%、玉米粉3%。1.3 影响复合菌对豆粕发酵生产大豆多肽的因素本研究将多菌种组合对豆粕进行固体发酵，然后通过测定发酵底物中抗营养因子、蛋白质（CP ）含量、低分子（14.4～20.1kDa）蛋白含量（隆丁法）、底物蛋白酶活性和底物菌量等方法，研究营养盐、重金属离子、天然高蛋白物质及表面活性剂等因素对生物发酵生产大豆多肽效果的影响。1.3.1 营养盐对产酶的影响将本试验所用营养盐配制成水溶液，每1 L 溶液中含0.5 g NH4H2PO4，2.0 g K2HPO4，0.3 g NaCl，2.0 g MgSO4，2.5 mg MnSO4.H2O，7.5 mg FeSO4.7H2O，0.4 g CuSO4·5H2O。营养盐中的磷酸盐对培养基有重要的缓冲作用。磷元素是核酸、磷脂和一些辅酶的组成成分。钾离子和钠离子可改变细胞渗透压，钾离子还是细胞内的主要阳离子，尤其是磷酸己糖激酶的辅助因子。Cu 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ 以及 Mg 2+都是相关酶的辅助因子。添加营养盐有利于复合菌对豆粕的发酵。1.3.2 金属离子对产酶的影响在基础培养基中（不含营养盐），添加0.01%各种金属盐，发现Ca2+对纤维素酶、蛋白酶的分泌有促进作用，Zn2+对果胶酶的分泌有促进作用，Mg2+对蛋白酶的分泌有促进作用，K+对酶活无影响。低浓度的Hg2+ 、Cr3+、Mn2+对蛋白酶的的分泌促进作用，但对纤维素酶、果胶酶活性影响不大。1.3.3 天然高蛋白物质对产酶的影响添加适量的天然高蛋白物质A、B、C均能促进底物菌量的增长及蛋白酶的分泌，其中添加适量的天然高蛋白物质A经济效果最佳。此外，还发现一定浓度的特定表面活性剂有利于产纤维素酶细菌的生长及其分泌，但对产蛋白酶的生长及其分泌效果不显著。2 生物发酵酶解大豆多肽饲料在配方中的地位与作用2.1 多菌种组合发酵豆粕的必要性2.1.1 多菌种组合发酵豆粕的零抗原豆粕是最常用的植物性蛋白质饲料原料，尽管其蛋白含量较高、氨基酸组成较合理、能为动物较好地消化吸收，但其所含的胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原以及其它抗营养因子如大豆凝集素、非淀粉多糖（木聚糖、果胶、甘露聚糖）、植酸、酚类化合物、胃肠胀气因子、脲酶等限制了其在部分养殖对象或养殖对象的特定养殖阶段中的应用。多菌种组合对豆粕复合发酵，可以将绝大部分抗营养因子予以清除，实现“零” 抗原。本研究的生产的大豆多肽饲料：不良寡糖（蜜三糖、水苏四糖）小于1%，抗胰蛋白酶含量小于1mg/g蛋白，凝血素小于6ppm，脲酶活性小于0.1mg/g.min，致甲状腺肿素、大豆抗原（ß－大豆伴球蛋白与大豆球蛋白等）与植酸均未检出。经多菌种组合发酵的豆粕，其中的抗营养因子大部分被分解和转化，因此它没有一般植物蛋白的过敏原性问题，能完全取代畜、禽日粮中的动物源性蛋白原料。在配方中的配比可以根据营养的需要不受限制。即使幼龄动物（如断乳仔猪）也不会因过量使用出现腹泻、生长迟缓等营养性疾病，这对幼龄动物而言，意义重大。发酵豆粕已成为一种在配方设计时可任意选用的无抗原新型常规蛋白原料。2.1.2 动物源性蛋白原料短缺、价高且存在着安全隐患由于大豆蛋白中的存在着过敏源、抗营养因子以及所含的蛋白80%以上为大分子蛋白（分子量超过100 kDa），使得大豆蛋白的溶解性低、消化率和生物学效价远不及牛乳、鸡蛋与鱼粉等动物源性蛋白质。所以，人们习惯使用价格昂贵的动物源性蛋白配制高档饲料。然而，我国动物蛋白原料资源非常短缺，优质鱼粉、乳清粉等动物制品货源大多依赖进口。近年来，随着市场需求的增大和相关资源的逐步枯竭，优质动物源性蛋白供应十分紧张，价格不断攀升，已严重影响我国养殖业的利润水平。另一方面，疯牛病的蔓延使人们认识到在饲料中使用动物源性蛋白（如肉骨粉）存在严重的安全性问题，且动物源性蛋白还有个科学使用问题如鱼粉在鸡日粮中配比使用不当就会引起胃肠组织糜烂，严重时甚至导致死亡。为了饲料工业、畜牧业的可持续发展，在饲料配方中完全或者大部分取代高价的鱼粉、乳清粉等动物制品是广大配方师必须面对的现实问题。大豆多肽饲料正是因应这一问题而被研制出来，是配制畜、禽、水产、特种养殖等各种功能性饲料，尤其是配制幼龄动物和特殊水产饲料的优质蛋白原料。近年来随着市场上，同类产品的不断推出，生物发酵豆粕已成为营养师的首选原料。2.2 多菌种组合发酵大豆多肽饲料的营养价值2.2.1 多菌种组合发酵大豆多肽饲料的高品质大豆多肽饲料是豆粕在特定的环境条件下，经过多种益生菌组合发酵降解大豆蛋白所得。本研究所用的益生菌主要为乳酸菌、枯草芽孢杆菌、粪链球菌、黑曲霉与酵母菌。首先，这些通过专业手段诱导、筛选、纯化的复合益生菌在生长繁殖过程中会产生大量的消化酶，如非淀粉多糖（NSP）酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、植酸酶等，这些消化酶不仅能去除豆粕中的抗营养因子，破除植物细胞壁、提高蛋白的消化利用率，同时将大分子蛋白降解成小分子蛋白质和部分寡肽，使得大豆多肽饲料具有独特的寡肽功能特性。而且随着大豆多肽饲料作为原料在配合饲料中的添加，这些消化酶作为动物体内外源酶的大量补充，又可提高配合饲料中其它营养物质的消化率与利用率。其次，微生物在发酵过程中还会产生大量的有机酸如乳酸、乙酸、小分子脂肪酸等，配合饲料中使用发酵豆粕可以明显降低饲料的系酸力，减少酸化剂的用量。第三，发酵底物中存留有许多其它酶类、维生素、氨基酸以及一些促生长的活性因子，大大提高了大豆多肽饲料的价值，因而受到了广泛重视。2.2.2 生物发酵大豆多肽饲料的肽营养大豆多肽饲料中的寡肽（2～10个氨基酸残基组成的寡肽）具有多种生理功能，如能直接通过动物肠道黏膜吸收，还能有效促进动物对饲粮中氨基酸的平衡吸收并显著提高饲粮中矿物元素的吸收与利用率。此外，大豆寡肽还可促进消化道中双歧杆菌和乳酸菌的增殖，具有抗氧化的功能，并能显著提高动物免疫功能。2.2.3 生物发酵大豆多肽饲料安全性高产品在生产过程中没有产生化学污染和病源菌污染的机会，相比动物源性蛋白，植物源性蛋白的品质更稳定，更安全，更可靠。3 营养功能首先，动物采食添加大豆多肽的饲料后，消化道内补充大量益生菌、乳酸和消化酶，能抑制肠道中有害菌的繁殖，保持肠道健康的微生态环境，改善动物小肠机能，产品中蛋白质消化率高达95%，饲料转化率和氮的利用率大幅提高，营养性腹泻减少，大肠中的异常发酵大大减少，动物排泄物中氨和吲哚类化合物大幅减少，直接表现为养殖栏舍内臭味大大减轻。其次，由于产品的肽营养特点，它能提高饲粮中氨基酸和矿物元素的吸收利用率，减少环境污染。在反刍动物中应用，还可促进瘤胃微生物生长。第三，产品中具有生物活性的小肽能显著提高血液中胰岛素水平，促进淋巴细胞增生，提高动物免疫功能。最后，在水产饲料上添加大豆多肽的饲料后，由于其溶解性好，黏度低，抗凝胶形成性好等优良的物理特性，能减少水产饲料的腐败，保护水质。4 结束语总之，本研究开发出了一套新的多益生菌种组合发酵生产大豆多肽的技术，发酵水平（乳酸含量、益生菌数、蛋白分解率）跟市场同类产品相当，并经动物饲养试验证实其效应。同时对多菌种组合、发酵条件等进行了工业化研究，适合产业化开发。采用该技术既可有效去除植物蛋白中的抗营养因子，又可降解蛋白生产大豆多肽。通过产生小肽的技术提高植物蛋白的品质，使得用植物蛋白原料代替配合饲料中的动物蛋白原料成为可能，符合中国植物饼粕多的国情，符合绿色、环保的产业政策，又符合世界饲料工业发展的趋势，且在产品的安全性、性价比方面具有很大优势，市场前景广。（参考文献略）