摘要:对用壳聚糖絮凝大豆蛋白发酵液进行研究 ,讨论pH值、絮凝剂浓度、温度和搅拌时间对絮凝效果的影响 ,结果是壳聚糖用量200 mgΠL、pH值为4、搅拌12 min、温度30 ℃时效果最好。 关键词:壳聚糖;大豆蛋白;发酵液;絮凝　　在大豆蛋白发酵液中 ,微生物及未发酵的培养基残渣等聚集成大颗粒 ,影响了过滤效果 ,通过对多种絮凝剂的絮凝试验 ,确定了采用安全性高的壳聚糖 ,并对其适宜的浓度及影响絮凝的因素进行了试验。在实验中应用絮凝剂对发酵液进行预处理后 ,使发酵液中的杂质去除率大大提高 ,这样不仅增加了经济效益 ,还提高了大豆多肽的纯度。 大豆蛋白发酵液的生产是靠枯草芽孢杆菌在大豆发酵培养中 ,在菌体内合成蛋白酶再分泌出菌体之外 ,进入发酵液中 ,待发酵至多肽产量最高点 ,进行放罐过滤 ,提纯浓缩 ,最后精制成成品。发酵过程中 ,发酵液中存在有机氮源如脱脂豆粉等 ,这些有机氮源中的氨基酸、蛋白质被菌体利用 ,在发酵终结时 ,发酵液中仍有未被利用的蛋白质类及少量菌体死亡生成的蛋白类 ,它们以固相和液相两种状态存在于发酵液中。以液相存在的杂质颗粒非常小 ,很难被滤布拦截 ,还容易堵塞滤布微孔进而影响过滤 ,就会导致提取浓缩时分离困难 ,进而严重影响最终产品的产量和质量。为了使微小的颗粒聚集成大颗粒 ,本试验采用絮凝剂解决发酵液的过滤问题。 无机絮凝剂大部分为铁盐、铝盐 ,不可用于食品工业中 ,故不宜采用。高分子有机絮凝剂有天然和合成两种 ,合成性絮凝剂的安全性值得考虑。因此 ,我们选用了天然无毒性的壳聚糖(CS)产品。壳聚糖也叫壳多糖或几多糖 ,是甲壳素的脱乙酰基产物 ,广泛存在于昆虫、甲壳类动物虾、蟹等外壳及真菌细胞壁中。壳聚糖的化学名称是 1 ,4 - 2 - 胺基 - 2 -脱氧 - B - D - 葡萄糖 ,因材料和制备方法的不同 ,相对分子量从数十万到数百万不等。壳聚糖分子中有游离氨基 ,在酸性条件中成为质子带正电荷 ,既是一种天然的阳离子絮凝剂 ,又是一种天然的高分子螯合剂 ,可使水中的悬浮物凝聚而沉降。由于壳聚糖具有特殊的理化性质及生物功能 ,被广泛的应用于食品、医药、生物、化工和造纸等领域1- 3 。因此 ,壳聚糖既可以在食品中用作絮凝剂 ,又可以处理食品加工厂的废水 ,减少水源污染。1 　材料与方法1.1 　材料1.1.1 　试剂 　 实验所用的大豆蛋白发酵液由本实验室提供 ,其他试剂均为分析纯。1.1.2 　主要仪器和设备 　 TU - 1800 紫外可见分光光度计 ,CJJ79 - 1 磁力加热搅拌器 ,水浴锅 ,pHs- 3C型pH计。1.2 　实验方法1.2.1 　发酵液预处理 　 在不同pH值条件下 ,菌体呈现不同电性 ,絮凝剂也呈现不同的活性。由于壳聚糖属于阳离子絮凝剂 ,因此在絮凝实验前 ,先将发酵液分成若干份 ,用 HCL 分别调pH值为酸性 ,检验壳聚糖絮凝剂在不同酸性环境中对大豆蛋白发酵液的絮凝效果 ,以确定絮凝剂对大豆蛋白发酵液产生有效絮凝效果的酸性条件。1.2.2 　絮凝剂浓度的配制 　 用二次重蒸水将壳聚糖配制成浓度为0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 gΠL 的溶液 ,将若干组发酵液 45 ml 用盐酸调至相应 pH值 ,然后依次加入不同浓度壳聚糖溶液 5 ml ,使絮凝处理后的发酵液中壳聚糖的浓度分别为 0. 05、0. 10、0.15、0.20 和0.25 gΠL。1.2.3 　絮凝操作 　 取调好pH值的发酵液45 ml ,倒入150 ml 烧杯中 ,在温和的电磁搅拌下加入 5 ml 絮凝剂 (空白样加 5 ml 蒸馏水) 继续搅拌 ,后静置30 min ,实验在室温下进行(夏季25～30 ℃) 。1.2.4 　絮凝效果的比较 　 将絮凝液静置30 min后 ,在3 000 rΠmin条件下离心10 min ,常压过滤。取1 ml上清液稀释 ,用紫外分光光度计以蒸馏水做空白于280 nm 处测 OD 值(optical density) ,与空白试样比较 ,算出 FR 值(flocculatinratio ,即絮凝率) 。FR 定义如下4 : FR= (OD1 - OD2 )Π(OD1 - OD3 ) ×100 %,FR 值越大 ,说明絮凝效果越好。 OD1 :絮凝前发酵液的OD值 OD2 :絮凝后发酵液的OD值 OD3 :絮凝前发酵液经10%三氯醋酸处理后OD值1.2. 5 　过滤效果的比较　 将絮凝后的发酵液以3 000 rΠmin离心后 ,用漏斗定性滤纸常压过滤 ,观察滤液的清亮程度。1.2.6 　絮凝对大豆蛋白肽的影响 　 大豆蛋白肽的相对变化率 = (肽含量絮凝前 - 含量絮凝后) /肽含量絮凝前 ×100 %1.2.7 　絮凝条件的确定 　正交实验确定1.2.8 　发酵液中多肽含量的测定51.2.9 　OD280的测定 　280 nm下紫外分光光度计测定2 　结果及讨论2.1 　絮凝条件的确定2.1.1 　不同絮凝剂浓度对絮凝效果的影响 　在pH值自然的条件下 ,在室温下搅拌 ,静止 30 min 后过滤 ,取上清液稀释测 OD 值。结果如图 1。实验显示 ,体系中絮凝剂浓度影响絮凝效果。这是因为絮凝剂是通过和不同颗粒表面结合产生架桥联结 ,生成絮团 ,从而起絮凝作用的。絮凝剂浓度的增加有助于架桥充分 ,但过多的加入反而会引起吸附饱和在每个胶粒上形成覆盖层 ,而使胶粒产生再次稳定现象 ,浪费原料。实验结果显示壳聚糖浓度在150～200 mgΠL 时絮凝效果最好。2.1.2 　不同 pH值对絮凝效果的影响 　 用 HCL 将发酵液分别调成 3、4、5、6、7 ,加入絮凝剂 ,在室温下搅拌 ,静止 30 min 后 ,过滤 ,取上清液稀释 ,测 OD值。结果如图2。 发酵液 pH值大于 6 ,由于 pH值对絮凝效果有很大影响 ,必须调整发酵液 pH 值。这是由于溶液pH值的变化会影响菌体胶粒和絮凝剂的电离度 ,从而影响分子链的伸展程度。在较高 pH 值条件下 ,絮凝剂分子链从卷曲状态变为伸展状态 ,提高了架桥能力 ,同时 ,微粒表面带有较多负电荷 ,絮凝剂发挥电荷中和与架桥的双重作用 ,有利于絮凝。实验结果显示壳聚糖在pH值为4 时絮凝效果最好。2.1.3 　不同搅拌时间对絮凝效果的影响　 分别在1 min、5 min、10 min、15 min、20 min 下搅拌,静止30 min后过滤,取上清液稀释测OD值。结果如图3。 絮凝是一个复杂的化学动力学过程 ,搅拌方式对絮凝效果有很大的影响。这可能是如果搅拌不充分 ,则絮凝剂和菌体微粒不能充分混合 ,从而影响絮凝效果。如果在絮团形成以后继续剧烈搅拌 ,则会使已形成的絮团破碎 ,使体系重新达到平衡 ,影响絮凝效果。由图3 中的结果可知 ,絮凝率随着搅拌时间的增加而提高 ,但在 15 min 后提高幅度不大。这可能是因为 ,实验使用的是粉末状壳聚糖 ,比表面积大 ,短时间搅拌便能使壳聚糖和发酵液有较充分的接触。为了既节能 ,又尽可能使絮凝效果最好(使壳聚糖的絮凝能力趋向饱和) ,本实验选定搅拌时间为15～20 min。2.1.4 　不同温度对絮凝效果的影响 　分别在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃下搅拌 ,静止 30 min 后过滤 ,取上清液稀释测OD值。结果如图4。实验结果显示 ,温度影响絮凝效果并不大。温度越低(但大于25 ℃) ,絮凝效果越好 ,这是因为 ,壳聚糖的絮凝吸附是一个放热过程。但并不是温度越低越好 ,这体现在 25～30 ℃下的 OD280 (此温度区间内絮凝率最大 ,为46 %)比35～40 ℃下的大。从实际情况出发 ,最好选室温(夏季)作为处理温度。2.2 　絮凝最佳条件的确定 为选择最佳的絮凝工艺条件 ,实验室在单因素实验后 ,进行了正交实验 ,选用四因素三水平的正交实验 ,其因素水平表和实验结果见表1 ,表2。2.3 　絮凝对大豆蛋白肽的影响 在最佳工艺条件下 ,大豆蛋白肽相对变化率平均为3.75 %,由此可以看出采用壳聚糖作为絮凝剂对大豆蛋白肽的浓度没有显著的影响。3 　结 　论 (1)壳聚糖属于一种高分子聚合物,絮凝是通过长碳链上的一些活性官能团,可在同一个分子上吸附多个微粒。因而它在微粒之间产生了联系作用,这种作用称为架桥作用。由于这种作用,可以将许多微粒连接在一起形成一个絮团。在本研究中,菌体等首先与凝聚剂起作用,拉掉了水化膜的水分子后,就使菌体蛋白质的活性键、羰基、羟基和胺基暴露出来,随后与高分子絮凝剂的活性基团相互键合,发生架桥作用,使菌体形成大的絮块后可离心除去。 (2)大豆蛋白发酵液经壳聚糖絮凝处理,发酵液由混浊变得澄清透亮,同时大豆多肽浓度没有显著降低。 (3)最佳工艺条件是当壳聚糖浓度为 200 mgΠL、pH值为4 ,在30 ℃的温度下搅拌12 min ,放置30 min过滤。参考文献:1 　蒋挺大.甲壳素M. 北京:化学工业出版社 ,2003.2 　张 　凯 ,郝晓东 ,黄渝鸿 ,等. 甲壳素及壳聚糖的应用J . 应用化工 ,2004 ,33(3) :6 - 8.3 　赖风英 ,向东 ,梁平. 壳聚糖在食品工业中的应用J .中国甜菜糖业 ,2004 ,2:28 - 30.4　程 　丽, 梁金钟. 絮凝法预处理大豆蛋白活性肽发酵液的研究J . 大豆通报 ,2004 ,2:17 - 19.5 　鲁 　伟 ,任国谱 ,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的测定方法J . 食品科学 ,2005 ,26(7) :169 - 171.