张映新，李素霞，杨梓，袁勤生*（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）摘 要 目的 实现羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中的可溶性表达,并对表达产物进行激活和纯化，得到活性羧肽酶B。方法 采用摇瓶发酵,对诱导温度,诱导时间,诱导剂IPTG的浓度进行优化,促成其可溶性表达；优化酶解激活条件,提高粗酶液比活。粗酶液用DEAE-FF离子交换柱和Octyl-FF疏水柱两步纯化。结果 确定实现可溶性表达的最佳条件为：15℃下，0.1mmol/LIPTG诱导20h。此条件下得到的粗酶液经激活后两步纯化，得到比活为128.2u/mg的较纯的活性CPB，活性回收率达39%。结论 羧肽酶原B在大肠杆菌中成功实现可溶性表达，酶原经激活纯化后可以得到重组活性羧肽酶B。关键词 羧肽酶B；可溶性表达；激活；纯化中图分类号： 文献标识码： 文章编号： 羧肽酶B（EC3.4.17.2，Carboxypeptidase B,简称CPB）是一种含锌的切割蛋白质和多肽的外肽酶，能特异性地从多肽的C端位置水解碱性氨基酸，包括精氨酸，赖氨酸和鸟氨酸[1]。在体内，CPB主要以酶原的形式存在。前CPB在小肠体内活化，经胰蛋白酶剪切形成具有蛋白水解活性的CPB。活化的CPB含307个氨基酸，分子量为35KD。由于其对C-末端碱性氨基酸的高度特异性，已经发现CPB具有广泛的用途。例如在末端氨基酸分析中用于序列确定[2]。在工业生产中，CPB用于产生具有医药用途的胰岛素的生产过程。目前，商业化的羧肽酶B主要是从动物胰腺中提取获得。李素霞等[3]通过基因重组的方法在E.coli中表达了CPB，但形成了包涵体。本研究通过优化发酵条件，首次实现了重组CPB的可溶性表达，每升可得31mg的重组CPB，为实现工业化生产奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒和菌株 质粒：PT7-473-pCPB，中科院生物工程中心构建。表达菌株BL21（DE23），由本室李素霞博士在中科院上海生物工程中心构建。1.1.2 主要仪器和试剂 J2-21M 高速冷冻离心机（BECKMAN）；高速台式离心机（上海医用分析仪器厂）；分光光度计（UNICO，UV-2100）；JM-250型电泳仪(大连捷迈科贸有限公司）。马尿酰-L-精氨酸，Sigma；胰蛋白酶（250NF.U/mg），Sigma分装；苯甲基磺酰氟（PMSF），华美生物工程公司；DEAE sepharoseTM快速分离胶，Amersharm(中国)有限公司；Octyl sepharoseTM分离胶，Amersharm(中国)有限公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 细菌平板培养 取含抗生素（Amp100mg/L）的LB培养皿，接种上含重组质粒的菌株，37℃过夜培养。1.2.2 摇瓶发酵培养 取经活化后BL21（DE3）菌株的单菌落，接入到含100mg/L氨苄青霉素（Amp）的LB培养液中37℃摇瓶过夜培养，次日按2%的接种量转入二级瓶，37℃继续生长至一定菌体密度，加入IPTG进行诱导。基金项目：上海市重点学科建设资助项目作者简介：张映新，1979年生，男，安徽铜陵人，硕士研究生，主要从事生化药物研究通讯作者：袁勤生，博士生导师。Tel：021-64252255 E-mail：qsyuan@ecust.edu.cn ,1.2.3 诱导条件的优化 过夜培养细菌，2%接种于含Amp100mg/L的LB培养基中，分别对诱导温度，诱导剂IPTG的浓度，诱导时间等进行优化，并取样作SDS-PAGE电泳分析。1.2.4 酶解条件的优化 根据优化好的培养条件培养菌体，超声破碎后得上清，加入不同质量比例的胰蛋白酶，37℃酶解后，测活。1.2.5 DEAE-FF Sepharose分离纯化CPB DEAE-FF Sepharose于上柱前用20mmol/L Tris-HCl, PH8.0缓冲液平衡，酶解液直接上柱，用含80mmol/L的NaCl的20mmol/L Tris-HCl, PH8.0洗脱，分部收集，测各收集管的OD280及酶活性。1.2.6 Octyl-FF进一步纯化CPB 合并DEAE-FF洗脱液，加入1倍体积的1.6mol/L（NH4）2SO4使终浓度为0.8mol/L（NH4）2SO4，上柱Octyl-FF（事先用0.8mol/L（NH4）2SO4平衡）。用0.4mol/L（NH4）2SO4洗脱，收集活性峰，测活，SDS-PAGE电泳检测。1.2.7 蛋白含量的测定 用Bradford法[4]测蛋白浓度，牛血清白蛋白为标准蛋白。1.2.8 羧肽酶B活性测定 参照Folk的方法[5]，含0.1mol/LNaCl的1mmol/L马尿酰-L-精氨酸为底物，25℃下测定。活力单位定义：25℃时，每分钟催化水解1μmol 马尿酰-L-精氨酸，导致254nm处1cm路径长的光吸收增加0.12的酶量定义为一个活力单位。2 结 果2.1 摇瓶培养条件优化2.1.1 诱导温度的选择 在实验中，我们选取了37℃，23℃，18℃，15℃四个温度进行比较，其中37℃诱导5h，其余全部诱导过夜。通过SDS-PAGE分析（图1）可知，在37℃下pCPB完全以包涵体形式表达，上清中没有目的蛋白存在。温度降到23℃，上清中开始出现少量目的蛋白，18℃时上清中的表达量增加，而当温度降至15℃时，则目的蛋白几乎完全以可溶性形式表达，破碎离心后，看不到包涵体。可见，降低温度有助于实现目的蛋白的可溶性表达。因此，我们采用15℃下低温诱导。kD M 1 2 3 4 5 6 7 83120.114.43120.14366.297.4M. protein marker; 1. lysed E.coli at 37℃; 2. supernatant at 37℃; 3. lysed E.coli at 23℃; 4. supernatant at 23℃;5. lysed E.coli at 18℃; 6. supernatant at 18℃; 7. lysed E.coli at 15℃; 8. supernatant at 15℃Fig 1 Effect of temperature on pCPB soluble expression2.1.2 诱导时间的选择将过夜培养的菌液按2%转接入二级瓶，37℃继续生长至菌密度0.6~0.8，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，置15℃摇床培养。每隔2h取样一次。通过测定OD600我们观察到，在加入诱导剂2~3h时，蛋白表达量上升较快，之后线形平稳上升。在诱导20h后，表达量开始趋于平稳，我们选择15℃下诱导20h。2.1.3 不同诱导剂浓度对pCPB可溶性表达量的影响不改变培养条件，加入不同浓度的IPTG，浓度范围0.01~0.5mmol/L,15℃下诱导20h，收集菌体并超声破碎后取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如下： 1 2 3 4 5 6 7 8pCPB1. Protein marker; 2. 0.01mmol/L IPTG; 3. 0.025mmol/L IPTG; 4. 0.05mmol/L IPTG; 5. 0.075mmol/L IPTG;6. 0.1mmol/L IPTG; 7. 0.25mmol/L IPTG; 8. 0.5mmol/L IPTGFig 2 Effect of IPTG concentration on pCPB soluble expression过高浓度的诱导剂容易造成蛋白的过量表达，形成包涵体。由图2可以看出，IPTG浓度在0.1mmol/L时，上清中目的蛋白表达量相对较高。这说明，适当降低诱导剂的浓度，可以一定程度上抑制蛋白的过量表达，避免发生错误折叠而形成包涵体。2.1.4 培养基中添加不同浓度的Zn2+对pCPB表达及CPB活性的影响羧肽酶B是一种含Zn2+的金属酶，Zn2+是其辅因子，是酶发挥活性所必需的。因此，我们在实验中考察了在培养基中加入不同浓度的Zn2+，研究其对CPB发挥酶活性的影响。 Fig3 Effect of Zn2+ concentration on CPB Special activity由上图可以看出，当培养基中加入0.001mg/mL ZnSO4时，未优化前的粗酶液酶活最高。Zn2+浓度过低可能消耗的快，而浓度过高则有可能会抑制活性。且我们通过对照发现，加入Zn2+后，CPB比活明显比对照组比活高。说明在表达过程中适当添加Zn2+，有助于提高CPB的酶活。2.2 酶解条件优化2.2.1 不同胰蛋白酶的量对酶解液活性的影响 1 2 3 4 5 6 7 8pCPBCPB