【摘要】 目的 从人正常皮肤组织中提取β?防御素?3基因进行定点突变后在E.coli中融合表达。方法 从人正常皮肤组织中提取总RNA，经RT?PCR扩增得到编码β?防御素?3成熟肽的cDNA序列，测序正确后，寻找合适的突变位点，设计含突变位点的引物，用PCR重叠延伸法对β?防御素?3成熟肽cDNA序列进行定点突变，将突变产物克隆至pUC18进行序列测定及在E.coli中融合表达。结果 测序结果表明，经RT?PCR所得的β?防御素?3成熟肽序列与GeneBank中报道的编码人β?防御素?3成熟肽的cDNA序列完全一致。经过突变β?防御素?3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA，其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β?防御素?3基因在E.coli中诱导表达3～5h后可见突变β?防御素?3蛋白表达。结论 成功构建并表达了β?防御素?3突变体基因，为进一步对突变体进行真核表达、生物活性研究奠定了基础。 【关键词】 人体β?防御素?3； 定点突变； 基因克隆； 测序； 基因表达　　Construction and expression of a site?directed mutant gene　of human beta?defensin?3　　ABSTRACT Objective To extract the gene encoding human beta?defensin?3 (hBD?3) from human foreskin tissue, make a site?directed mutagensis and expression with the mutant gene in E.coli. Methods The total RNA extracted from human foreskin tissue and the sequence of cDNA encoding hBD?3 was amplified by RT?PCR. After sequencing, a pair of mutant primers was designed and site?directed mutation was made by over?lap extension PCR and then the mutant gene was expressed in E.coli. Results Sequencing analysis indicated that hBD?3 DNA obtained by RT?PCR was identical to the sequence reported in GenBank. After mutation, the code CAG for glutamine was changed into the code CGA for arginine at position 29. After induction for 3～5 hours, a new protein band appeared on SDS?PAGE gel. Conclusion Mutant hBD?3 (mhBD?3) gene is constructed and expressed in E.coli BL21 successfully. It might provide a foundation for construction of eukaryotic expression vector and research of its biological activity. 　　KEY WORDS Human beta?defensin?3; Site?directed mutagensis; Gene cloning; Sequencing; Gene expression　　抗菌肽是生物体产生的一类抗微生物的阳离子小分子多肽，是生物天然免疫的重要组成部分［1］。由于这些物质对许多致病菌都有抗菌作用，而且无致畸作用，无蓄积毒性，最为重要的是在机体内不易产生耐药性，因此有望开发为新型的抗生素，以解决日益严重的传统抗生素耐药性问题。 　　　　防御素(defensin)是近年来发现的一组富含半胱氨酸残基的抗菌肽，主要存在于上皮组织中，构成机体抵御病原微生物侵袭的第一道化学屏障［2］。人体β?防御素?3(human beta?defensin?3，hBD?3)是新近被克隆出来的第三种人源性β?防御素。它主要对革兰阳性菌如金葡菌具有高效、广谱的杀伤作用，对盐离子浓度不敏感，在生理盐浓度范围内不易产生溶血现象［3］，具有研究和应用价值。为了进一步研究hBD?3的结构与其抗菌活性间的关系，我们应用PCR重叠延伸法对hBD?3成熟肽cDNA的分子结构进行改造，得到突变体hBD?3(mutant human beta?defensin?3，mhBD?3)并进行mhBD?3的原核表达，以期得到抗菌谱更广、抗菌活性更稳定的抗菌肽。　　1 材料与方法　　1.1 材料 　　总RNA提取试剂盒、一步法反转录试剂盒、Taq酶、pUC18质粒、T4DNA连接酶均购自华美公司；菌株DH5α、BL21为本实验室保存；DNA凝胶回收试剂盒、快速质粒小量提取试剂盒均购自上海生工公司；限制性内切酶、DL2000 DNA Marker购自大连TaKaRa公司；pGEX?4T?1购自Pharmacia公司；PCR引物由上海生工公司合成。　　1.2 方法　　1.2.1 细胞总RNA的提取 临床获取正常人新鲜包皮组织约150mg，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，操作按说明书进行。　　1.2.2 RT?PCR扩增人hBD?3 cDNA 根据GenBank中编码hBD?3成熟肽的45个氨基酸的cDNA序列设计一对引物，引物序列如下：上游引物(a)：5′?GGGAATTCGGAATCATAAACAC?3′，在引物5′端加上EcoRI酶切位点，并设计GG两个保护碱基；下游引物(b)5′?GGGTCGACTTATTTCTTTCTTC?3′在引物5′端加上SalI酶切位点，并设计GG两个保护碱基。以提取的总RNA为模板，a和b为引物进行RT?PCR。RT?PCR按试剂盒说明书进行，取10μl RT?PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并记录结果。　　1.2.3 hBD?3基因的克隆及序列测定 将PCR扩增产物和pUC18用EcoRI和SalI双酶切，回收纯化后16℃连接过夜，转化于用常规CaCl2法制备的感受态E.coli DH5α中，经蓝白筛选挑取白色菌落，提取质粒，双酶切及针对pUC18多克隆位点设计如下引物进行PCR鉴定。上游引物：5′?GCCAGGGTTTTCCC?AGTC?3′，下游引物：5′?GCGGATAACAATTT?CACA?3′，并送上海生工测序。　　1.2.4 hBD?3基因的突变 根据hBD?3的分子结构，找出合适的突变位点，设计一对突变引物，引物序列如下：突变上游引物(c)：5′?GAGGAACGAATCG?GCAAGTGCT?3′，突变下游引物(d)：5′?CGAGCACTTGCCGATTCGTTCC?3′。应用PCR重叠延伸法［4］对hBD?3基因进行定点突变(Fig.1)。①片段AD的获得：用引物a和d进行PCR反应，10×缓冲液5μl，MgCl2 3μl，dNTPs 4μl，引物a和d各1μl，模板1μl，无菌双蒸水34μl，Taq酶1μl，共50μl反应体系。94℃预变性5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，72℃延伸7min，取10μl扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察结果；②片段CB的获得：用引物c和b进行PCR反应，反应条件同上；③PCR重叠延伸：用凝胶回收后的AD和CB作为模板，用引物a和b进行PCR反应，10×缓冲液5μl，MgCl2 3μl，dNTPs 4μl，引物a和b各1μl，模板AD和CB各5μl，无菌双蒸水25μl，Taq酶1μl，共50μl反应体系。94℃变性5min，72℃退火并延伸7min，然后94℃预变性5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，共27个循环，72℃延伸7min，取10μl扩增产物AB于2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察结果。　　1.2.5 mhBD?3基因的克隆及序列测定 将PCR重叠延伸产物和pUC18用EcoRI和SalI双酶切，回收纯化后在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。常规CaCl2法制备感受态E.coli DH5α，取5μl连接产物转化于200μl感受态细胞中。在含IPTG、X?gal的氨苄西林培养基上挑取白色菌落，用上海生工的小量质粒快速抽提试剂盒抽提质粒，用EcoRI和SalI双酶切及用针对pUC18多克隆位点的引物进行PCR鉴定，重组质粒送上海生工公司测序。　　1.2.6 mhBD?3基因的表达 用EcoRI和SalI双酶切含有mhBD?3基因片段的重组质粒pUC18?mhBD?3和表达载体pGEX?4T?1回收纯化后16℃连接过夜，转化于感受态E.coli BL21中，双酶切、PCR筛选阳性克隆。挑取单个阳性克隆接种于3ml含氨苄西林(0.005%)的LB培养基中过夜。次日按1∶100接种于含氨苄西林(0.005%)新鲜的LB培养基中，37℃培养3h，加入IPTG终浓度为0.5mmol/L，诱导表达3～5h，取2.0ml菌液，5000r/min，离心5min，收集菌体。用15μl H2O重悬菌体，加入等体积的2×上样缓冲液(100mmol/L Tris?Cl pH6.8，200mmol/L 2?巯基乙醇，20%甘油，4% SDS，0.1%溴酚兰)混匀，100℃煮沸3～5min，离心取上清20μl进行堆积胶浓度为5%，分离胶浓度为15%的SDS?PAGE电泳，用考马斯亮蓝G250染色，观察mhBD?3基因的表达结果。2 结果　　2.1 RT?PCR扩增hBD?3 cDNA 　　RT?PCR扩增出约150bp左右的特异条带，和预期的hBD?3 cDNA大小一致(Fig.2)。　　2.2 hBD?3基因序列测定 　　所获hBD?3成熟肽的cDNA序列与GenBank中报道的序列相一致(图略)。　　2.3 hBD?3基因的突变 　　经前两次PCR得到产物AD和CB分别约为98和60bp，再经PCR重叠延伸得到产物约为154bp(Fig.3)。　　2.4 重组质粒的筛选及鉴定 　　重组质粒pUC18?mhBD?3经EcoRI+SalI双酶切后，可见约为138bp的小片段。经PCR扩增后可见克隆重组体扩增的片段约为270bp的目的片段，pUC18扩增的片段约140bp，说明在pUC18中插入约为130bp的片段(Fig.4)。　　2.5 mhBD?3基因的序列分析序列分析结果表明，hBD?3成熟肽mRNA第29位密码子CAG突变为CGA， 氨基酸相应由谷氨酰胺突变为精氨酸，其他核苷酸序列均未发现改变(图略)。　　2.6 mhBD?3基因在大肠埃希菌中的表达 　　pGEX?4T?1为一种GST融合表达载体，含GST基因，编码25.8ku的谷胱甘肽?巯基转移酶(glitathione S?transferse)。在IPTG的诱导下以GST融合蛋白的形式表达目的基因。GST与多克隆位点之间有凝血酶酶切位点，目的蛋白可用凝血酶从表达的融合蛋白上切割下来。重组的表达质粒pGEX?4T?1?mhBD?3转化E.coli BL21，阳性转化子经IPTG诱导，在Ptac启动子启动下表达。经SDS?PAGE电泳，用考马斯亮蓝G250染色结果，在约30.8ku处有一条明显的条带，GST与mhBD?3基因融合表达后融合蛋白约为30.8ku。　　3 讨论 　　防御素是人体内主要的抗菌肽，包括α?防御素和β?防御素两种［5］。其中β?防御素主要来源于皮肤、呼吸道等上皮组织，目前已发现4种人体β?防御素(human beta?defensin，hBD)。hBD?1是于1995年由Bensch等［6］从人血滤液中分离纯化获得；hBD?2是Harder等［7］于1997年从人牛皮癣组织中分离纯化得到。2001年Harder等［3］采用金葡菌亲和柱从人牛皮癣组织中分离纯化得到了hBD?3。hBD?4也于2001年发现，只是在感染时选择性的表达于某些组织中。hBD?1和hBD?2主要对革兰阴性菌如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等有很强的抗菌活性，但对现在耐药最严重的并引起皮肤脓肿、心内膜炎等一系列临床病症的革兰阳性菌则表现出较弱的抗菌活性［8］。hBD?3不同于前两者，它在很小的剂量范围内就表现出对金葡菌、耐万古霉素的肠球菌、化脓链球菌等革兰阳性菌的抗菌活性［3］。hBD?3独具的这一特性与其结构有关。研究表明，与hBD?1和hBD?2相比较，hBD?3分子可形成两亲性二聚体结构，而hBD?1和hBD?2分子均为单体结构。此外，hBD?3分子所带的净正电荷(+11)高于hBD?1(+5)和hBD?2(+6)所带的净正电荷［9］。 　　hBD?3分子由67个氨基酸组成，其中含22个氨基酸的信号肽和45个氨基酸的成熟肽，成熟肽分子中含有6个半胱氨酸残基，形成3对二硫键，分子内含有7个精氨酸和6个赖氨酸残基。Hoover等［10］在研究hBD?3结构与活性的关系时，根据hBD?3结构序列合成了一系列短肽，这些短肽几种是hBD?3序列的一部分，几种是对原hBD?3分子中的氨基酸进行替换，它们大小不同，二硫键配对方式不同，所带电荷数不同。通过对这几种hBD?3衍生物的抗菌活性实验，Hoover等发现hBD?3的抗菌活性与其N?末端序列、分子中所含的精氨酸残基和芳香族氨基酸等因素密切相关。为了进一步研究hBD?3的结构与其杀菌活性的关系，开拓其在抗菌领域的应用前景，我们采用PCR重叠延伸法，使hBD?3成熟肽分子中的29位谷氨酰胺密码子CAG突变为精氨酸密码子CGA，增加了分子中的精氨酸数，使其分子净正电荷数由突变前+11价增加为突变后+12价，并成功构建了突变体的重组克隆和在E.coliBL21中的表达，为mhBD?3的真核表达、抗菌活性的研究奠定了基础。【参考文献】 　　［1］ 查向东，徐康森，刘兢. 阳离子抗菌肽研究进展［J］. 中国药理学通报，2003，19(7)：735　　［2］ Ganz T, Lehrer R I. Defensins ［J］. Pharmacol Ther,1995,66(2):191　　［3］ Harder J, Bartel J, Christophers E, et al. Isolation and characterization of human beta?defensin?3, a novel human inducible peptide antibiotic ［J］. Bio Chem,2001,276(8):5707　　［4］ 萨姆布鲁克J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南［M］. 北京：科学出版社，2002：1109　　［5］ Fellermann K, Stange E F. Defensins?innate immunity at the epithelial frontier ［J］. Eur J Gastroenterol Hepatol,2001,13(7):771　　［6］ Bensch K W, Raida M, Magert H J, et al. hBD?1: A novel beta?defensin from human plasma ［J］. FEBS LETT,1995,368(2):331　　［7］ Harder J, Bartel J, Christophers E, et al. A peptide antibiotic from human skin ［J］. Nature,1997,387(2):861　　［8］ Dinulos J G, Mentele L, Fredericks L P, et al. Keratinocyte expression of human beta defensin 2 following bacterial infection: role in cutaneous host defense ［J］. Clin Diagn Lab Immunol,2003,10(1):161　　［9］ Schibli D J, Hunter H N, Aseyev V, et al. The solution structures of the human β?defensin lead to a better understanding of the potent bactericidal activity of hBD?3 against Staphylococues aureus ［J］. Bio Chem,2002,277(10):8279　　［10］ Hoover D M, Wu Z B, Tucker K, et al. Antimicrobial characterization of human β?defensin 3 derivatives ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2003,47(9):2804