* 陈　琛1，2，王新华2，薄新文2* (1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.新疆生产建设兵团农垦科学院绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆石河子 832000) 摘　要：抗菌肽是在动植物体内发现的氨基酸数目少于100个的一类多肽，是哺乳动物防御体系的一个重要组成部分，具有分子质量小、对热稳定、水溶性好、广谱抗菌和作用机制独特等特点。文章主要综述了几种哺乳动物上皮细胞抗菌肽的分离纯化技术研究概况。 关键词：上皮细胞抗菌肽；分离纯化；层析；哺乳动物 哺乳动物的皮肤和黏膜直接与外界接触，是病原体入侵的门户，为了抵御病原体的入侵，当机体受病原微生物刺激后在上皮细胞(气管、舌和小肠等黏膜)产生抗菌肽[1-2]。这些小分子抗菌肽构成病原微生物入侵的第一道分子屏障，也是生物体先天性免疫的重要组成部分[ 3]。抗菌肽具有抗细菌、真菌、原虫和一些有被膜病毒的作用，作用机制独特，不易产生耐药性，在医药卫生和食品防腐等方面显示有广阔的应用前景[4]，故从不同的哺乳动物上皮细胞中分离纯化具有抗菌活性的多肽是研究的重点。 1　抗菌肽的特点 1.1　抗菌肽的理化特点 抗菌肽的理化性质主要有以下几点：①分子质量小，氨基酸组成少于100个。②热稳定性高，100 ℃加热10 min～15 mim，仍能保持一定的活力。③水溶性好。④等电点(pI)一般大于7，具有较强的阳离子特征。 1.2　抗菌肽的生物功能特点 抗菌肽的生物功能特点主要有：①广谱高效的抗菌活性。抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及原虫均有高效广谱的杀伤作用，并且它的抗[CM22－22]菌浓度小，一般在微摩尔水平。②抗病毒活性。抗 菌肽对疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒等有囊膜病毒有明显的杀伤力。③不易产生耐药性。相对传统的抗生素而言，细菌对抗菌肽更难产生耐药性。④抗肿瘤活性。使肿瘤细胞不能贴壁和正常生长。⑤无残留、无毒副作用。 2　哺乳类动物上皮细胞抗菌肽的分离纯化 哺乳动物抗菌肽研究起步较杀菌肽(cecropin)、蛙皮素(magainin)、蜂毒肽(melittin)和防御素(defensin)晚，但是发展速度较快，至今已经分离纯化或克隆得到数百种哺乳动物上皮细胞抗菌肽。 2.1　牛上皮细胞抗菌肽的分离纯化 牛抗菌肽共有13种，主要包括[5-6]牛β-防御素(bovine neutrophil β-defensins，BND-β)、气管上皮抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide，TAP)、舌抗菌肽(bovine lingual antimicrobial peptide，LAP)、肠上皮细胞抗菌肽(intestinal epithelial antimicrobial peptide)，即肠肽素及牛肽聚糖识别蛋白[bovine peptidoglycan (PGN) recognition proteins，BPGRPs]。 Diamond G等[7]从牛气管黏膜分离得到TAP，它是从哺乳动物上皮细胞分离纯化得到的第一个抗菌肽，TAP的发现为其他的哺乳动物上皮细胞抗菌肽的发现奠定了坚实的基础。Tarver A P等[8]从牛小肠分离纯化得到牛肠肽素，其方法为采集牛小肠，液氮冻存，－70 ℃保存备用。粗提制备：剪碎，研磨，匀浆，用100 mL/L乙酸过夜搅拌浸提，过滤，液体用1 mol/L硫酸铵沉淀，离心，上清液浓缩即得粗提。纯化采用3步色谱技术，第一步凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography，GFC)，生物凝胶P-30(Bio-Gel P-30，排阻极限40 ku)，2. 0 cm×30 cm 的柱子，用50 mmol/L的乙酸铵(pH 4.1)平衡、2.5 mL/min流速洗脱，收集、冷冻干燥并做抑菌试验。有活性部分进行阳离子交换色谱，用330 g/L KH2PO4溶液平衡，0 mol/L～1 mol/L的NaCl线性梯度洗脱，收集冷冻干燥。将有抗菌活性的部分进行第三步分离纯化，反相高压液相色谱(RP-HPLC)，0.46 cm×22 cm C18反相柱，平衡1 mL/L三氟乙酸(TFA)水溶液，洗脱1 g/L TFA/乙腈，乙腈梯度0 mL/L～850 mL/L，洗脱速度1 mL/min，收集进行活性检测、分子量鉴定及序列测定。 Aono S等[9]从牛乳腺上皮细胞克隆到一种新的牛β-防御素，并进行真核细胞表达。重组表达蛋白用CM Macro-Prep树脂进行纯化，纯化抗菌肽进行质谱分析，氨基酸测序。BPGRPs的纯化则先将粗提产物采用10 cm× 25 cm C18 catridge进行浓缩，再用RP-HPLC进行纯化，平衡1 mL/L TFA水溶液，洗脱1 mL/L TFA/乙腈，乙腈梯度0 mL/L～420 mL/L[10]。 2.2　绵羊上皮细胞抗菌肽分离纯化 绵羊抗菌肽包括3类共11种。这3类分别是防御素(defensin)、Cathelicidins、绵羊肺部表面活性物质阴离子抗菌肽(surfactant-associated anionic peptides， SAAPs)。截止目前，这11种绵羊抗菌肽中Cathelicidins类的SMAP29和SMAP34已能人工化学合成；OaBac5从绵羊中性粒细胞中分离纯化，SAAPs从绵羊肺部分离纯化，其他7种均为克隆得到的cDNA序列，还没有从蛋白质水平分离纯化得到。 SAAPs分离纯化方法如下[11]：用蒸馏水冲洗绵羊肺脏，收集冲洗液，在4 ℃ 以30 000 r/min离心1 h。上清液用高压液相色谱纯化，0.39 cm×30 cm C18 柱，0.1% TFA、10%～100%乙腈，梯度洗脱，洗脱速度1 mL/min。213 nm～217 nm波长测定吸光度，收集洗脱液进行抑菌活性检测，氨基酸序列测定，最后得到仅含7个氨基酸的SAAPs。 2.3　猪上皮细胞抗菌肽分离纯化 已经从猪体内发现至少13 种以上不同的抗菌肽，中性粒细胞中存在10种，上皮细胞中存在3种，即猪β-防御素1(porcine beta-defensins 1，PBD-1)、猪天蚕素1(cecropin P1)和PR-39(proline-arginine-rich with a size of 39 residues)。其中PBD-1从猪舌上皮细胞克隆得到，Cecropin P1和PR-39从蛋白水平分离纯化得到，PR-39既存在于猪粒细胞，又存在于猪小肠上皮细胞[12]。 猪Cecropin P1分离纯化采用3步层析技术[13]。猪小肠上皮细胞抗菌肽粗提物制备方法为：950 mL/L的乙醇室温浸提猪小肠上皮细胞24 h，过滤除去沉淀，冷冻干燥得到粗提物。第一步离子交换层析，将冷冻干燥粗提产物溶解在0.1 mol/L甲酸铵(pH 6.4)中，进行CM-Sepharose阳离子交换色谱，用上述缓冲液平衡，先用0.1 mol/L甲酸铵(pH 6.4)洗脱，再继续用0.1 mol/L～0.85 mol/L的乙酸铵(pH 5.2)梯度洗脱，280 nm波长测定吸光度，收集，冷冻干燥。将冷冻干燥产物溶解在水中，做抑菌活性检测。第二步用Sepharose进行纯化，平衡0.3 mmol/L乙酸铵(pH 5.2)，先用此平衡液洗脱230 mL至基线出现，再用0.3 mol/L～0.5 mol/L的乙酸铵梯度洗脱。检测波长同上，收集，冷冻干燥溶解在1 mL/L TFA中进行第三步纯化，上样于反相FPLC，平衡1 mL/L TFA水溶液，洗脱1 mL/L TFA/乙腈，0 mL/L～48 mL/L的乙腈梯度洗脱，收集进行抗菌活性检测，重复进行3次FPLC纯化。氨基酸序列测定、分子质量大小鉴定，最终分离得到含31个氨基酸，分子质量为3.326 ku的Cecropin P1。Agerberth B等[14]从猪小肠上皮细胞分离得到PR-39。方法是粗提猪小肠上皮细胞抗菌蛋白，将粗提物分别进行Medium和Fine Sephadex G-25凝胶过滤，离子交换CM-cellulose，经过3步纯化后，得到氨基酸数目为39个，分子质量4.719 ku的PR-39。 此外，马卫明等[15]采用两步凝胶过滤层析，Sephadex G-100和G-25纯化得到具有抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的猪小肠抗菌肽类似物。 2.4　鼠上皮细胞抗菌肽分离纯化 Ouellette A J等[16]从鼠小肠上皮细胞分离纯化到小肠防御素。方法是将鼠小肠匀浆，300 mL/L乙酸浸提。在4 ℃以15 000 r/min离心30 min，取上清冷冻干燥。冷冻干燥产物溶解在300 mL/L乙酸中，进行凝胶过滤层析。第一步凝胶过滤层析，Bio-Gel P-60(排阻极限60 ku)，1.0 cm× 60 cm柱子，300 mL/L乙酸平衡、洗脱，流速1.67 mL/min，收集冷冻干燥。第二步将凝胶过滤冷冻干燥产物溶解在300 mL/L乙酸中进行RP-HPLC纯化。RP-HPLC纯化用1 cm×25 cm C18柱，平衡1.3 mL/L七氟乙酸，0 mL/L～400 mL/L的乙腈梯度洗脱，流速3 mL/min，收集冷冻干燥，活性检测。重复进行1次RP-HPLC纯化，平衡1 mL/L TFA水溶液，洗脱160 mL/L～210 mL/L的乙腈梯度洗脱，流速同上。 Ayabe T等[17]也从鼠小肠上皮潘氏细胞中分离纯化得到肠肽素，方法是300 mL/L乙酸浸提鼠小肠上皮细胞即得粗提。纯化采用RP-HPLC，平衡1 mL/L TFA水溶液，100 mL/L～450 mL/L的乙腈梯度洗脱。收集、活性检测，质谱分析及氨基酸测序。 2.5　狗上皮细胞抗菌肽分离纯化 陈正望等[18]从狗小肠中分离纯化得到分子质量约为4 ku的生物活性肽。方法如下：将新鲜狗小肠去脂，加入0.5 mol/L 乙酸，匀浆，4 ℃搅拌浸提24 h，离心(4 ℃，7 000 r/min ，25 min)，收集上清液。上清液用2 mol/L HCl调pH至2.7，加入海藻酸，缓慢搅拌30 min后静置10 min，倾去液体，用布氏漏斗收集海藻酸，用0.002 mol/L HCl (100 mL)清洗海藻酸，抽滤并去滤液，再向海藻酸中加入0.2 mol/L HCl (100 mL)洗脱，收集洗脱液，用乙酸钠调pH至3.5，加入NaCl(320 g/L)35 g搅拌15 min后于4 ℃静置过夜，次日用布氏漏斗收集盐析物，－20 ℃保存。乙醇沉淀分离。将上述盐析物溶于50 mL的0.2 mol/L 乙酸，抽滤，滤液调pH至7.2，加入乙醇200 mL，－20 ℃冰箱静置48 h，去上清，将浊液离心收集沉淀物。 第一步Sephadex G-25 (Fine)凝胶过滤层析分离。用0.2 mol/L乙酸平衡凝胶柱。取上述沉淀物溶于乙酸中，离心(10 000 r/min，12 min) ，取上清上凝胶柱，用0.2 mol/L乙酸洗脱，流速1.8 mL/min，220 nm波长测定吸光度，按峰收集，洗脱液冷冻干燥。 最后用RP-HPLC分离纯化。用20%的B液(含0.1% TFA的乙腈)平衡反相柱(ODS2C18 )。将样品溶于A液(含体积分数为0.1% TFA的超纯水)，每次的上样量为20 μg (1 μg/μL) ，用体积分数为20%～50%的B液梯度洗脱30 min，流速1 mL/min，214 nm 波长测定吸光度，按峰收集后冻干，检测活性。 2.6　恒河猴上皮细胞抗菌肽分离纯化 从恒河猴体内发现13种抗菌肽，可分为两类，一类是来源于恒河猴骨髓细胞α-防御素1-7(rhesus macaque myeloid α-defensins，RMADs)，另一类是恒河猴肠肽素1-6，(rhesus enteric α–defensins，REDs)。7个RMAD从恒河猴骨髓细胞中分离纯化得到，恒河猴肠肽素4(RED-4)用生物化学方法从小肠上皮细胞分离纯化得到，其方法如下[19]：恒河猴小肠粗提制备产物用300 mL/L乙酸浸提，4 ℃以25 000 r/min离心2 h，收集上清。上清进行Bio-Gel P-30层析纯化，用50 mL/L的乙酸洗脱。收集各峰利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子质量并进行抑菌活性检测，若有抗菌活性并且分子质量≤10 ku的收集峰再进行下一步分离纯化。第二步RP-HPLC纯化，用硅胶C18柱，缓冲液为0.1% TFA水溶液，15%～45%的乙腈梯度洗脱150 min。收集、检测活性、测序得到RED-4。 2.7　人上皮细胞抗菌肽的分离纯化 人上皮细胞中主要存在以下几种抗菌肽：α-防御素(Human neutrophil defensins，HNP)、β-防御素(Human beta-defensins，HBD)和Cathelicidins类抗菌肽。α-防御素又称为人中性粒细胞防御素。 已发现的HNP共有6种，主要产生于中性粒细胞(HNP 1-4)和小肠潘氏细胞(HNP 5-6)[20]。HBD也有6种，HBD1-3主要存在于各器官表面的上皮细胞(如消化道、呼吸道、泌尿生殖道、角膜等)，HBD-4在睾丸和胃窦部的表达量最高，在子宫、中性粒细胞、肺和肾脏也有低量持续表达，HBD 5-6的表达常局限于附睾。人的上皮细胞Cathelicidins类抗菌肽主要是LL-37。 Howell S J等[20]从人结肠上皮细胞分离纯化得到4个抗菌肽。方法是剥取人结肠上皮黏膜，按1 g上皮黏膜加10 mL 200 mL/L乙酸，再分别加入1.5 mmol/L E64、1 mmol/L胃蛋白酶抑制剂、2 mmol/L亮抑酶肽、1.5 mmol/L抑亮氨酸氨肽酶、80 mmol/L抑肽酶，然后超声波细胞破碎仪破碎细胞，4 ℃过夜浸提，离心收集上清，调pH至7.0，即得粗提物。第一步纯化采用离子交换层析，利用CM弱阳离子交换纤维素(Bio-Rad)树脂，10 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4)洗脱。第二步阳离子交换高压液相层析，柱子0.46 cm×20 cm，洗脱缓冲液A为20 mmol/L，pH 6.0的乙酸铵；缓冲液B 10 mL/L～100 0 mol/L乙酸梯度洗脱，洗脱速度1 mL/min，收集检测生物活性和测定蛋白含量。活性最强的部分进行最后一步RP-HPLC纯化，用0.21 cm× 25 cm C18反相柱。洗脱缓冲液0.1% TFA /50 mol/L～100 0 mol/L乙腈，梯度洗脱，洗脱速度0.35 mL/min，214 nm 波长测定吸光度，收集，进行抗菌活性检测，经2次RP-HPLC纯化后得到5种较纯的组分，其中4种具有抗菌活性。 李明等[21]分离、鉴定了人子宫黏液抗菌多肽。方法如下：收集健康女性子宫黏液，50 mL/L乙酸浸提，离心去沉淀、上清透析、冷冻干燥。进行尿素-PAGE电泳分析，活性检测，切割抗菌条带，进行制备电泳，电洗脱。进行RP-HPLC纯化，1 mL/L TFA/0 mL/L～600 mL/L乙腈线性梯度洗脱，流速1 mL/min。收集洗脱液， 冷冻干燥后溶于0.1 mL/L乙酸，检测抗菌活性。 3　展望 哺乳动物上皮细胞抗菌肽分离纯化技术主要有凝胶过滤层析、离子交换层析和高压液相层析等，在具体的分离过程中根据不同的组织材料将这3种技术结合运用，最终达到高效的分离纯化目的。不断改进的抗菌肽活性检测技术(琼脂糖孔穴扩散法、微量肉汤稀释法)和质谱技术为分离纯化提供了强有力的技术支撑，解决了分离纯化产物鉴定中技术难点。仍存在的问题是从动物上皮细胞分离纯化抗菌肽含量较低，成本高，无法满足临床应用。相信在基因工程技术快速发展的今天，将会有一批抗菌活性高的抗菌肽新产品实现批量生产。 参考文献（略） *收稿日期：2006-08-07 基金项目：兵团科技局基础研究项目(2006JC01) 作者简介：陈 琛(1978－)，男，陕西宝鸡人，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防制研究。*通讯作者