范 淳 陈代文 余 冰 杨 玫
摘 要 由小肽转运载体介导的小肽吸收对动物的生长和发育有着特殊的作用，因此，对小肽转运载体的深入研究在生理、药理和临床上都有着非常重要的意义。文中主要从小肽转运载体（PepT1和PepT2）的蛋白质分子结构与功能、主要的组织分布和影响其活性的因素三方面进行简要综述。
关键词 小肽转运载体；PepT1；PepT2；组织分布；活性调控
中图分类号 Q514+.2
近几十年来，小肽营养理论的提出为传统蛋白质营养的发展带来了一个新的亮点。人们逐渐意识到，摄入的蛋白质经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，并不一定要成为游离的氨基酸后才能被机体吸收和利用，许多小肽形式的降解物都能直接通过胃肠道黏膜进入体循环，供机体不同组织利用。然而，实现这一过程需要小肽转运载体的介导。
小肽转运载体属于依赖质子的寡肽转运载体（POT）家族的成员（Paulsen和Skurray，1994）,它主要转运绝大多数的二肽和三肽，以及一些肽类药物(Ganapathy等，1994)。它是一种以H+梯度为动力，将肠腔和其它组织中的小肽从细胞外转运到细胞内的一种蛋白质，对小肽的吸收起关键作用。本文将主要对两种小肽转运载体（PepT1和PepT2）的研究进展进行综述。
1 小肽转运载体的分子结构和功能
目前，已知的属于POT家族的转运载体包括PepT1（SLC15A1）、PepT2（SLC15A2）、PHT1和PHT2等。但是，研究最深入的是前两者。来自人和许多试验动物的PepT1和PepT2基因已经被成功克隆，且人们对其蛋白质分子结构进行了比较系统的研究。
1.1 PepT1的蛋白质分子结构
几乎被克隆的所有动物的PepT1蛋白质都有12个由α 螺旋构成的假想跨膜区（Klang等2005发现，猪的PepT1有13个跨膜区，包括一个额外的氨基端，且氨基端在细胞内，羧基端在细胞外），其氨基端和羧基端都位于胞质一侧。在第9跨膜区和第10跨膜区之间有一个较大的亲水环，位于细胞膜的外侧，上面有与N相连的3～7个数目不等的糖基化位点。大多数物种的PepT1在细胞内环上有一个蛋白激酶C（PKC）和一个蛋白激酶A（PKA）的磷酸化位点，但也有例外：人的PepT1有2个PKC磷酸化位点而无PKA磷酸化位点；绵羊的PepT1有4个PKC磷酸化位点和3个PKA磷酸化位点。
不同种类的动物小肠中PepT1的mRNA长度有所不同，所编码的蛋白质的氨基酸组成数目也不同，但分子量相同，都为79 kDa。其中猪的两条PepT1 mRNA长度分别为2.9和3.5 kb，编码由708个氨基酸组成的蛋白质，与人、绵羊、鸡的氨基酸序列的同源性分别为82.8%、85.7%、64.7%（Klang等，2005）。而其它动物，包括猴（Zhang等，2004）、绵羊（Pan等，2001）、鸡（Chen等，2002）、兔（Fei等，1994）、人（Liang等，1995）、小鼠（Fei等，2001）和大鼠（Saito等，1995）的小肠中PepT1 mRNA长度分别为2.1、2.8、1.9、2.9、3.3、3.1和2.9 kb，分别编码由708、707、714、707、708、709和710个氨基酸组成的蛋白质。
所有跨膜区内的氨基酸序列都高度保守，而胞外环上的氨基酸序列保守的很少。不同动物的PepT1氨基酸序列具有高度的同源性，但与其它一些已知的转运蛋白间却没有同源性。
1.2 PepT2的蛋白质分子结构
尽管PepT2与PepT1属于同一家族，但它们却是两种不同的转运体系。PepT2的分子量较大，由729个氨基酸组成。两者的共同特征是都有12个假想的跨膜区，且在跨膜区之间有一个大的细胞外环和几个依赖性蛋白激酶的磷酸化位点。
不同种类动物的PepT2的mRNA长度不同，比如人的PepT2的mRNA全长是2.7 kb，并有一长为2.2 kb的开放阅读框；而大鼠的PepT2的mRNA长度为3.9 kb。
对于同种动物，其PepT1和PepT2的氨基酸序列同源性低于不同动物相同转运体系之间的同源性。例如，人的PepT2与PepT1氨基酸序列仅有50%的同源性；而与大鼠的PepT2的氨基酸序列却有83%的同源性。
1.3 氨基酸残基与底物结合位点
PepT1和PepT2有着相当广泛的底物特异性，大约400种二肽和8 000种三肽都能被其转运，而不论分子量、所带电荷和疏水性是否相同。此外，这两种转运载体还介导许多肽类药物的吸收，包括青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺类抗生素、抗癌药物苯丁抑制素、血管紧张素转化酶抑制剂、肾素抑制剂和凝血酶素抑制剂等（Sai等，1996；Inui等，2000；Rubio-Aliaga和Daniel，2002)。
早期研究表明，随着细胞外pH值在5.5～7.4的变化，与底物结合位点相关的一些氨基酸残基将逐步显现出来。Terada等（1996）研究发现，在PepT1中的两种候选残基可能为His57和His121。近年来，对PepT1中的His57（PepT2中保守的His87）进行了点突变的研究，当位于第2跨膜区的His57用Ala、Asp或Glu点突变后，抑制了肽的吸收。
此外，对其它保守的His残基（如PepT1的His121和PepT2的His142）的作用也有研究。Terada等（1998）让PepT1的His121突变成Glu，结果当其在卵母细胞中表达时，PepT1不能转运Gly-Sar，也不能转运β-内酰胺类抗生素。而当PepT2中的His142突变时，PepT2的转运能力依然存在，但有一定的降低。这表明His142对于PepT2的转运很重要，但不是必需的。
Fei等（1997）又识别出第三个保守的His残基（PepT1中的His260和PepT2中的His278），但研究发现，对肽的转运无影响。Chen等（2000）进一步证实His57对维持PepT1的正常功能是必需的，而His121参与了可转运底物的识别。而Meredith等（2000）认为His57质子化提供氢键电位或者His121提供盐桥来结合二肽或三肽的羧基端。
然而，His并不是唯一进行基因点突变研究的残基，位于第5跨膜区的Tyr167对转运功能也有着重要意义（Yeung等，1998）。事实上，Tyr167对于正常转运功能的确是必需的，这可能是由于它的侧链酚的化学结构。此外，通过计算机模型，识别出在人的PepT1中，Trp294和Glu595对小肽的有效转运也是必需的。
总的来说，跨膜区上的这些氨基酸残基对于维持PepT1和PepT2的正常转运功能有着非常重要的意义。当底物与这些结合位点结合后，通过蛋白质的3D结构变化来形成适宜的几何构造，执行转运功能。因此，小肽转运载体的独特分子结构和它的功能是紧密联系的。
2 小肽转运载体的组织分布
PepT1是肠肽转运载体，主要在小肠表达，且位于上皮细胞刷状缘膜囊，以吸收蛋白质降解的产物小肽。对于反刍动物，PepT1主要分布在瘤胃、瓣胃和十二指肠的上皮细胞上。而PepT2是肾肽转运载体，主要在肾脏表达，功能是重吸收滤过肽、肽类衍生物和内质网腔的肽酶产生的肽（Boll等，1996）。此外，这两种转运载体在动物机体的其余组织中也有表达，如PepT2在大脑、乳腺、肺和胰腺中也有分布(Daniel 和Kottra，2004；Smith等，2004)。
2.1 肠道
Freeman等（1995）试验发现，兔的PepT1在肠道不同部位的表达有一定的差异，主要位于绒毛的上皮细胞，十二指肠和空肠的表达最多，回肠较低，结肠最低；而胃、圆形囊泡和盲肠中没有表达。
猪的PepT1分布与此类似，十二指肠和空肠的mRNA含量高，回肠的含量较低。在鸡中的分布则以十二指肠为主，直肠较少。然而，对于大鼠，回肠PepT1的mRNA含量却比十二指肠和空肠多得多。
2.2 肾脏
PepT2的mRNA和蛋白在肾近端小管S2和S3段（直部）的上皮细胞顶膜上高度表达，相比之下PepT1在肾中的表达较少，位于近端小管S1段（曲部）（Shen等，1999）。Smith等（1998）在其它肾单元片段没有发现这两种异构体的表达。分析认为，肽在肾单元的重吸收可能是一个连续的两步过程：即低亲和力、高容量的PepT1执行着大多数的重吸收作用；而高亲和力、低容量的PepT2清除超滤后残余的肽。
2.3 乳腺
Doring等（1998）通过RT-PCR（反转录-聚合酶链式反应）发现PepT2的mRNA可在兔的乳腺中存在。位于乳腺上皮细胞的PepT2参与了由乳蛋白质水解后的小肽的重吸收和某些肽类药物在母体和乳中的循环分布，PepT2的重吸收作用使得这些肽类药物在乳中的残留大大减少（Groneberg等，2002）。
2.4 胰腺
PepT1可在胰腺细胞内表达。其中，PepT1在胰腺溶酶体的定位可能有助于清除由溶酶体内蛋白降解形成的小肽。然而，它在细胞核的功能还不清楚，可能涉及到假定的肽信号在细胞核和细胞质间的移动。此外，Gonzalez等（1998）发现两种胰腺癌细胞都有PepT1的表达，定位于质膜和细胞内多孔结构，这无疑对胰腺癌的治疗有着重要的意义。如果肽转运载体仅在癌细胞中表达，那么就可能利用其来转运某些抗癌的肽类药物（如苯丁抑制素）。
2.5 大脑与中枢神经系统（CNS）
大脑中没有PepT1的分布，而Doring等（1998）证实PepT2可在兔的大脑中表达。Berger和Hediger（1999）进一步发现，PepT2主要在大脑皮层、星形胶质细胞、室管膜细胞和脉络丛上皮细胞等表达。特别地，PepT2在脉络丛上皮细胞顶膜的高度表达可以通过血脑屏障将神经肽、肽片段和肽类药物从脑脊液转运流向血液，调控细胞外液中神经肽的水平，以维持其稳态（Shu等，2002；Shen等，2004）。
对于中枢神经系统，PepT2可在视网膜的Muller细胞和背侧根神经节的卫星细胞中表达（Dieck等，1999）。Dringen等（1998）研究发现，已知的PepT2底物可抑制谷胱甘肽的前体物Cys-Gly在星形胶质细胞中的吸收，而RT-PCR又检测到PepT2的存在。这一结果暗示，PepT2可能牵涉到CNS的抗氧化机制。
2.6 其它组织
Groneberg等（2001）研究表明，肺中的PepT2定位于肺泡的II型肺细胞、支气管上皮组织和小血管内皮组织，参与二肽、三肽和肽类药物在肺中的吸收。尽管Liang等（1995）在人的胎盘中检测到PepT1的mRNA存在，但目前对于胎盘的肽转运系统还不是很清楚。PepT1在肝脏中的表达很少，在猪、绵羊和大鼠等动物的肝脏中甚至没有表达。
3 小肽转运载体活性的调控
目前，对小肽转运载体活性的调控研究主要集中在对小肠的PepT1上，而对PepT2的研究并不多。
PepT1的表达及其活性可以被许多因素所调控，包括底物和动物年龄、发育、营养水平、激素、昼夜节律等。这些因素对其活性的上调和下调作用主要通过三条途径来实现：第一，通过pH值的变化来改变顶端的质子动力势；第二，动用囊泡贮存的小肽转运载体使其定位于肠黏膜上；第三，改变基因及其mRNA的转录和稳定性。
3.1 底物
小肽转运载体主要转运二肽和三肽，而这些寡肽底物无疑会对其活性有所影响。Thamotharan等（1998）用人的小肠Caco-2细胞作模型，研究了单个寡肽对PepT1的活性调控。结果发现，用10 mmol/l的Gly-Sar处理后的24 h，细胞顶膜的肽转运载体数量增加，而Western印迹法分析表明，PepT1的蛋白表达水平增加了两倍。当用游离的甘氨酸和肌氨酸代替时，则无效果。
虽然Gly-Sar常作为测定小肽转运载体功能表达的底物，但由于不是天然的二肽，故不具有代表性。为此，Walker等（1998）用Gly-Gln做了类似的试验，结果表明，PepT1的细胞mRNA水平和膜上蛋白的表达都大约增加了两倍。
因此，无论是天然的还是化学合成的二肽都能通过调控小肽转运载体的基因表达来影响其活性。两种可能的作用机制是：①增加mRNA编码基因的稳定性；②通过刺激启动子的转活来增加基因的转录，而这种转活似乎与启动子的氨基酸应答元件有关。
3.2 动物年龄和发育
动物在成长发育阶段，其肠道消化系统将经历两次结构和功能的改变，分别在出生或孵化阶段和哺乳动物的断奶期。而为了适应这一变化，肠道的小肽转运载体的表达和活性也会发生相应的转变。许多试验表明，在动物的胚胎期，PepT1已有表达，到出生后水平逐渐升高；此后随年龄和个体发育迅速降低，但哺乳动物在断奶后PepT1表达水平会有短暂的回升。而肾脏中的PepT1和PepT2的表达水平会稳步上升，并在出生后两周达到最大值。
Chen等（2001）研究发现，肉鸡从胚胎期的第18 d到孵化日，小肠中的PepT1的mRNA丰度迅速增加。Van等（2005）研究发现，火鸡从孵化前5 d到孵化时，小肠组织中的PepT1的mRNA增加了3.2倍。Shen等（2001）报道，大鼠肠道PepT1的mRNA和蛋白质水平从出生前17 d到出生后75 d表现出有规律的变化；在出生后，十二指肠、空肠、回肠的PepT1的mRNA迅速增加，并在第3~5 d达到最大，然后迅速减少，但第24 d(在断奶时)又出现短暂的增加，特别是在回肠；成年大鼠PepT1的蛋白水平只有先前观察到的70%。分析认为，小肠PepT1的表达在产后被诱导，可能是通过哺乳实现的，而断奶后的短暂反弹可能是一种适应机制；但也有不一致的报道，Rome等（2002）发现，大鼠小肠PepT1的表达水平在出生后的第4~50 d都没有变化。
那么，在动物的不同发育阶段，诱导小肽转运载体表达的因素究竟有哪些呢？Thiesen等（2001）认为，内部和外部信号可能直接调控小肠小肽转运载体的活性，日粮蛋白和一些神经激素（甲状腺素、糖皮质激素、胰岛素等）可能参与了PepT1在发育阶段的表达调控。
3.3 营养水平
日粮的蛋白质水平可能是影响PepT1活性的最重要因素，起着上调作用。Shiraga等（1999）研究了日粮调控小肽转运载体活性的细胞和分子机制。结果表明，当含高水平蛋白质的日粮进入消化道后，迅速被胃肠道的蛋白酶降解，使二肽、三肽和氨基酸在肠腔里的浓度增加。而这些产物（选择性氨基酸如Phe、Arg和Lys，二肽如Gly-Sar、Gly-Phe、Lys-Phe和Asp-Lys）可作为信号激活PepT1基因的转录，使其活性增强，进而使PepT1在刷状缘膜上的表达增多。最终结果是增加了对小肽的转运，这可看作是小肠对高蛋白日粮的适应性自我调节。而Ogihara等（2004）发现，日粮中氨基酸的给予会减少大鼠小肠中小肽转运载体的数量，从而降低转运活性。
此外，营养不良也将显著影响动物对小肽的吸收。短期和长期的禁食都能上调小肠PepT1的活性表达，特别以小肠中段和上段最显著。
Ihara等（2000）研究发现，饥饿、半饥饿和静脉营养状态下大鼠的小肠黏膜重量减少，而PepT1 mRNA水平增加近两倍，其蛋白水平也相应提高。分析认为，动物在饥饿时，小肠的萎缩使可吸收表面积减少，在生理上为了平衡这一变化，小肠PepT1 mRNA和蛋白水平增加，使肠黏膜刷状缘膜上PepT1的数量增加，导致小肽的吸收不会减少。Shimakura等（2006）进一步发现，禁食诱导的小肠PepT1的mRNA水平的显著提高是由过氧化物酶体增生物激活受体（PPARα）介导的，从而调控小肠氮的吸收。
3.4 激素
3.4.1 甲状腺激素
D■ring等（2005）研究发现，甲状腺机能减退将导致肾脏中总的PepT2的mRNA水平增加，这意味着甲状腺素对PepT2有着一定的抑制作用。Ashida等（2002）用T3处理Caco-2细胞，发现T3抑制了[14C]Gly-Sar的吸收，并呈现时间和剂量依赖性。与对照组相比，PepT1的mRNA和蛋白数量都显著减少，分别为25%和70%，这可能是T3使PepT1的mRNA的转录和（或）稳定性下降。
尽管目前还没有发现甲状腺激素效应元件（TRE）在大鼠和小鼠PepT1基因的启动子区域内存在。但是，当甲状腺激素进入细胞核后，可与细胞核靶基因调节区域的TRE相互作用，形成甲状腺受体复合物，可能间接地影响其转录。
3.4.2 胰岛素
Thamotharan等（1999）用生理浓度的胰岛素处理Caco-2细胞，尽管60 min内PepT1的mRNA水平无变化，但二肽摄取的最大速度却增加2倍，且刺激作用发生快。尽管胰岛素不能使PepT1的合成增加，但当其与受体结合后，可以动员胞浆池中贮存的PepT1，并使之定位于膜上，从而增加PepT1蛋白的数量，也就增加了对小肽的转运。Nielsen等（2003）进一步发现，循环中的胰岛素是通过与小肠黏膜细胞基底外侧膜上的受体结合来调控小肽的转运，当胰岛素接触顶膜时，对小肽在顶端的吸收没有影响。
3.4.3 表皮生长因子（EGF）
Nielsen等（2001）用生理浓度的EGF培养Caco-2细胞，5 d后出现抑制作用，15 d后达到最大抑制作用。尽管Caco-2细胞的顶膜和基底外侧膜都有EGF的受体，但只有暴露在基底外侧膜的EGF才能抑制二肽的转运。分析认为，EGF可使PepT1的mRNA转录水平下降，导致PepT1的数量减少，从而减少了对小肽的转运。Bravo等（2004）研究表明，用EGF对大鼠肾近曲小管的SKPT细胞处理后，PepT2的转运能力和表达呈剂量依赖性的减少。这一抑制作用可能是通过降低其基因的转录或者减少其mRNA的稳定性来实现的。
然而，EGF对小肽吸收的抑制作用也有相反的报道。Nielsen等（2003）又将Caco-2细胞的基底外侧膜短期暴露于EGF，5 min后顶端二肽的吸收却呈现出剂量依赖性的增加，产生这一结果的具体原因尚不清楚。
3.4.4 瘦素
Buyse等（2001）用Caco-2细胞研究了瘦素（Leptin）对刺激肽吸收的作用机制。30 min内，Leptin增加了二肽和肽类抗生素在Caco-2细胞中的转运，但这一结果仅当Leptin加入到细胞顶端，而不是基底外侧时才被观察到。动力学的分析排除了Leptin通过对PepT1的内在修饰来调控其活性的可能性，真正原因是Leptin与胰岛素属于同一种调控机制。
3.5 昼夜节律
Pan等(2001)研究表明，小肠PepT1的蛋白活性和mRNA的表达是随着昼夜更替而变化的。随后，Pan等（2002）通过对大鼠进行12 h（8:00~20:00）的光照，并让其自由采食，来研究肽转运的昼夜节律性。结果表明，小肠的PepT1的mRNA和蛋白的丰度在16:00~24:00时更高，[14C]Gly-Sar在24:00时的吸收速度要显著快于12:00时。然而，肾脏中的PepT1的 mRNA和蛋白水平几乎没有昼夜节律性。
Pan等（2003）在禁食和非禁食两种条件下研究大鼠小肠PepT1的昼夜节律。结果发现，饲喂组和禁食1 d组都有显著的昼夜节律性；然而，禁食2 d后，节律性消失。分析认为，由于大鼠PepT1的启动子区域存在着肝细胞核因子（HNF-1）的潜在位点，可能同依赖Na+的葡萄糖转运载体一样，HNF-1的周期性改变与这一转录水平上的调控有关。
此外，还可能与摄食和神经内分泌机制有关。像大鼠这样的啮齿类动物有着夜间摄食的习惯，作为一种日常机制，增加PepT1的活性可以为体内营养素的吸收做准备。研究证实，在16:00时，肠内PepT1的mRNA水平已经开始提高。另外，摄食作为一种肠腔活动的信号，能够刺激某些激素（如胰岛素）的分泌，进而对PepT1进行调控。Pan等（2004）也认为，摄食而不是昼夜循环能够极大地影响PepT1表达的昼夜节律。
3.6 药理学试剂
某些药理学试剂能影响小肠中小肽转运载体的活性，进而影响小肽和肽类药物的转运。但这一类物质作用的分子机制有些目前还不是很清楚，如果能够阐明的话，将对人和动物某些疾病的治疗起着重要的作用。
Berlioz等（1999）研究发现，给大鼠服用可乐定（α2肾上腺素能受体激活剂）后，β-内酰胺类抗生素在小肠的吸收增加了两倍。原来可乐定可增加Caco-2细胞顶膜上的PepT1的数量，其作用机制和胰岛素一样。Tanaka等（1998）研究发现，给大鼠服用5-氟尿嘧啶（抗癌药）3 d后，刷状缘膜囊中的二肽转运没有显著差异。但是，PepT1的基因表达水平却增加了两倍。这暗示，PepT1 通过合成的增加，来抵抗由5-氟尿嘧啶引起的肠道细胞损伤，从而保证小肠内的肽吸收不受影响。Motohashi等（2001）研究了用两种免疫抑制剂他克莫司和环孢霉素处理Caco-2细胞后Gly-Sar的转运情况，结果都降低了PepT1的活性和二肽的跨细胞转运。虽然这一作用机制还不清楚，但PepT1 mRNA水平的下降可能与此无关。此外，脂多糖（LPS）也可使大鼠空肠和回肠的PepT1的mRNA丰度下降，蛋白表达减少。但当注射地塞米松后，LPS的作用被削弱。原因是LPS可使TNF-α和IL-1β等细胞因子增加，而地塞米松可减少它们的生成（Shu等，2002）。
3.7 PKA和PKC
小肽转运载体的蛋白质结构上存在着cAMP（环磷酸腺苷）依赖性的PKA和PKC的磷酸化位点，通过这些位点的可逆磷酸化调控载体的转运活性。
Fei等(1994)研究发现，提高细胞内cAMP的水平可以降低兔的PepT1蛋白的活性，抑制小肽的转运。Brandsch等（1994）研究表明，巴豆油酯对PKC的激活可使Caco-2细胞内的二肽转运受到抑制。Harcouet 等（1997）研究发现，胞内Ca2+浓度的增加使PKC活化，进而导致二肽的吸收减少。而Chen等（2002）报道，星状孢子体（PKC抑制剂）可以显著增加PepT1的转运活性。
因此，PKA和PKC的抑制剂能显著提高PepT1的转运活性，而激活因子能降低PepT1的转运活性。通过磷酸化或去磷酸化的翻译后修饰来调控PepT1是可能的，PepT1的活性与PKC 细胞信号系统直接相关，其磷酸化位点的改变导致了活性的抑制。
4 结语和展望
对小肽转运载体（PepT1和PepT2）的成功克隆表达，并对其分子结构、组织分布和功能的初步了解，为小肽营养的深入研究开辟了一个广阔的空间。深入探讨影响其转运活性的因素及其作用机制，可以更好地应用其独特的生物学功能，在生理和临床上都有着重要意义。比如，可以通过增加小肽转运载体的表达来提高普通临床状况下（如感染和高血压等）药物理疗的效果；而对于患糖尿病和感染性腹泻的病人，肠内需要的蛋白质营养应以二肽而不是氨基酸形式来提供氮源。在药理学上，小肽转运载体作为一种有效的药物运输途径，为以后的药物设计、药物运输和药物动力学提供了新的思路。
总的来说，虽然小肽转运载体的研究已取得了初步的成就，但仍有不少工作要完成。其蛋白质分子的二级、三级结构及其功能的关系需要进一步阐明。最近研究发现了某些非肽类物质（比如ω-氨基脂肪酸和δ-氨基乙酰丙酸等），尽管它们并没有任何肽键，但也是PepT1和PepT2转运的底物。此外，虽然对于小肽转运载体活性的调控因素已有了大量的研究，但其分子和转录水平上的调控依然不是很清楚。PepT1和PepT2仅仅是POT家族的两个成员，已发现的肾基底外侧膜和小肠基底外侧膜的肽转运系统都与这两者截然不同，其它的家族成员对（小）寡肽的转运目前也不清楚，需要进一步研究。
（参考文献61篇，刊略，需者可函索）
摘 要 由小肽转运载体介导的小肽吸收对动物的生长和发育有着特殊的作用，因此，对小肽转运载体的深入研究在生理、药理和临床上都有着非常重要的意义。文中主要从小肽转运载体（PepT1和PepT2）的蛋白质分子结构与功能、主要的组织分布和影响其活性的因素三方面进行简要综述。
关键词 小肽转运载体；PepT1；PepT2；组织分布；活性调控
中图分类号 Q514+.2
近几十年来，小肽营养理论的提出为传统蛋白质营养的发展带来了一个新的亮点。人们逐渐意识到，摄入的蛋白质经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，并不一定要成为游离的氨基酸后才能被机体吸收和利用，许多小肽形式的降解物都能直接通过胃肠道黏膜进入体循环，供机体不同组织利用。然而，实现这一过程需要小肽转运载体的介导。
小肽转运载体属于依赖质子的寡肽转运载体（POT）家族的成员（Paulsen和Skurray，1994）,它主要转运绝大多数的二肽和三肽，以及一些肽类药物(Ganapathy等，1994)。它是一种以H+梯度为动力，将肠腔和其它组织中的小肽从细胞外转运到细胞内的一种蛋白质，对小肽的吸收起关键作用。本文将主要对两种小肽转运载体（PepT1和PepT2）的研究进展进行综述。
1 小肽转运载体的分子结构和功能
目前，已知的属于POT家族的转运载体包括PepT1（SLC15A1）、PepT2（SLC15A2）、PHT1和PHT2等。但是，研究最深入的是前两者。来自人和许多试验动物的PepT1和PepT2基因已经被成功克隆，且人们对其蛋白质分子结构进行了比较系统的研究。
1.1 PepT1的蛋白质分子结构
几乎被克隆的所有动物的PepT1蛋白质都有12个由α 螺旋构成的假想跨膜区（Klang等2005发现，猪的PepT1有13个跨膜区，包括一个额外的氨基端，且氨基端在细胞内，羧基端在细胞外），其氨基端和羧基端都位于胞质一侧。在第9跨膜区和第10跨膜区之间有一个较大的亲水环，位于细胞膜的外侧，上面有与N相连的3～7个数目不等的糖基化位点。大多数物种的PepT1在细胞内环上有一个蛋白激酶C（PKC）和一个蛋白激酶A（PKA）的磷酸化位点，但也有例外：人的PepT1有2个PKC磷酸化位点而无PKA磷酸化位点；绵羊的PepT1有4个PKC磷酸化位点和3个PKA磷酸化位点。
不同种类的动物小肠中PepT1的mRNA长度有所不同，所编码的蛋白质的氨基酸组成数目也不同，但分子量相同，都为79 kDa。其中猪的两条PepT1 mRNA长度分别为2.9和3.5 kb，编码由708个氨基酸组成的蛋白质，与人、绵羊、鸡的氨基酸序列的同源性分别为82.8%、85.7%、64.7%（Klang等，2005）。而其它动物，包括猴（Zhang等，2004）、绵羊（Pan等，2001）、鸡（Chen等，2002）、兔（Fei等，1994）、人（Liang等，1995）、小鼠（Fei等，2001）和大鼠（Saito等，1995）的小肠中PepT1 mRNA长度分别为2.1、2.8、1.9、2.9、3.3、3.1和2.9 kb，分别编码由708、707、714、707、708、709和710个氨基酸组成的蛋白质。
所有跨膜区内的氨基酸序列都高度保守，而胞外环上的氨基酸序列保守的很少。不同动物的PepT1氨基酸序列具有高度的同源性，但与其它一些已知的转运蛋白间却没有同源性。
1.2 PepT2的蛋白质分子结构
尽管PepT2与PepT1属于同一家族，但它们却是两种不同的转运体系。PepT2的分子量较大，由729个氨基酸组成。两者的共同特征是都有12个假想的跨膜区，且在跨膜区之间有一个大的细胞外环和几个依赖性蛋白激酶的磷酸化位点。
不同种类动物的PepT2的mRNA长度不同，比如人的PepT2的mRNA全长是2.7 kb，并有一长为2.2 kb的开放阅读框；而大鼠的PepT2的mRNA长度为3.9 kb。
对于同种动物，其PepT1和PepT2的氨基酸序列同源性低于不同动物相同转运体系之间的同源性。例如，人的PepT2与PepT1氨基酸序列仅有50%的同源性；而与大鼠的PepT2的氨基酸序列却有83%的同源性。
1.3 氨基酸残基与底物结合位点
PepT1和PepT2有着相当广泛的底物特异性，大约400种二肽和8 000种三肽都能被其转运，而不论分子量、所带电荷和疏水性是否相同。此外，这两种转运载体还介导许多肽类药物的吸收，包括青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺类抗生素、抗癌药物苯丁抑制素、血管紧张素转化酶抑制剂、肾素抑制剂和凝血酶素抑制剂等（Sai等，1996；Inui等，2000；Rubio-Aliaga和Daniel，2002)。
早期研究表明，随着细胞外pH值在5.5～7.4的变化，与底物结合位点相关的一些氨基酸残基将逐步显现出来。Terada等（1996）研究发现，在PepT1中的两种候选残基可能为His57和His121。近年来，对PepT1中的His57（PepT2中保守的His87）进行了点突变的研究，当位于第2跨膜区的His57用Ala、Asp或Glu点突变后，抑制了肽的吸收。
此外，对其它保守的His残基（如PepT1的His121和PepT2的His142）的作用也有研究。Terada等（1998）让PepT1的His121突变成Glu，结果当其在卵母细胞中表达时，PepT1不能转运Gly-Sar，也不能转运β-内酰胺类抗生素。而当PepT2中的His142突变时，PepT2的转运能力依然存在，但有一定的降低。这表明His142对于PepT2的转运很重要，但不是必需的。
Fei等（1997）又识别出第三个保守的His残基（PepT1中的His260和PepT2中的His278），但研究发现，对肽的转运无影响。Chen等（2000）进一步证实His57对维持PepT1的正常功能是必需的，而His121参与了可转运底物的识别。而Meredith等（2000）认为His57质子化提供氢键电位或者His121提供盐桥来结合二肽或三肽的羧基端。
然而，His并不是唯一进行基因点突变研究的残基，位于第5跨膜区的Tyr167对转运功能也有着重要意义（Yeung等，1998）。事实上，Tyr167对于正常转运功能的确是必需的，这可能是由于它的侧链酚的化学结构。此外，通过计算机模型，识别出在人的PepT1中，Trp294和Glu595对小肽的有效转运也是必需的。
总的来说，跨膜区上的这些氨基酸残基对于维持PepT1和PepT2的正常转运功能有着非常重要的意义。当底物与这些结合位点结合后，通过蛋白质的3D结构变化来形成适宜的几何构造，执行转运功能。因此，小肽转运载体的独特分子结构和它的功能是紧密联系的。
2 小肽转运载体的组织分布
PepT1是肠肽转运载体，主要在小肠表达，且位于上皮细胞刷状缘膜囊，以吸收蛋白质降解的产物小肽。对于反刍动物，PepT1主要分布在瘤胃、瓣胃和十二指肠的上皮细胞上。而PepT2是肾肽转运载体，主要在肾脏表达，功能是重吸收滤过肽、肽类衍生物和内质网腔的肽酶产生的肽（Boll等，1996）。此外，这两种转运载体在动物机体的其余组织中也有表达，如PepT2在大脑、乳腺、肺和胰腺中也有分布(Daniel 和Kottra，2004；Smith等，2004)。
2.1 肠道
Freeman等（1995）试验发现，兔的PepT1在肠道不同部位的表达有一定的差异，主要位于绒毛的上皮细胞，十二指肠和空肠的表达最多，回肠较低，结肠最低；而胃、圆形囊泡和盲肠中没有表达。
猪的PepT1分布与此类似，十二指肠和空肠的mRNA含量高，回肠的含量较低。在鸡中的分布则以十二指肠为主，直肠较少。然而，对于大鼠，回肠PepT1的mRNA含量却比十二指肠和空肠多得多。
2.2 肾脏
PepT2的mRNA和蛋白在肾近端小管S2和S3段（直部）的上皮细胞顶膜上高度表达，相比之下PepT1在肾中的表达较少，位于近端小管S1段（曲部）（Shen等，1999）。Smith等（1998）在其它肾单元片段没有发现这两种异构体的表达。分析认为，肽在肾单元的重吸收可能是一个连续的两步过程：即低亲和力、高容量的PepT1执行着大多数的重吸收作用；而高亲和力、低容量的PepT2清除超滤后残余的肽。
2.3 乳腺
Doring等（1998）通过RT-PCR（反转录-聚合酶链式反应）发现PepT2的mRNA可在兔的乳腺中存在。位于乳腺上皮细胞的PepT2参与了由乳蛋白质水解后的小肽的重吸收和某些肽类药物在母体和乳中的循环分布，PepT2的重吸收作用使得这些肽类药物在乳中的残留大大减少（Groneberg等，2002）。
2.4 胰腺
PepT1可在胰腺细胞内表达。其中，PepT1在胰腺溶酶体的定位可能有助于清除由溶酶体内蛋白降解形成的小肽。然而，它在细胞核的功能还不清楚，可能涉及到假定的肽信号在细胞核和细胞质间的移动。此外，Gonzalez等（1998）发现两种胰腺癌细胞都有PepT1的表达，定位于质膜和细胞内多孔结构，这无疑对胰腺癌的治疗有着重要的意义。如果肽转运载体仅在癌细胞中表达，那么就可能利用其来转运某些抗癌的肽类药物（如苯丁抑制素）。
2.5 大脑与中枢神经系统（CNS）
大脑中没有PepT1的分布，而Doring等（1998）证实PepT2可在兔的大脑中表达。Berger和Hediger（1999）进一步发现，PepT2主要在大脑皮层、星形胶质细胞、室管膜细胞和脉络丛上皮细胞等表达。特别地，PepT2在脉络丛上皮细胞顶膜的高度表达可以通过血脑屏障将神经肽、肽片段和肽类药物从脑脊液转运流向血液，调控细胞外液中神经肽的水平，以维持其稳态（Shu等，2002；Shen等，2004）。
对于中枢神经系统，PepT2可在视网膜的Muller细胞和背侧根神经节的卫星细胞中表达（Dieck等，1999）。Dringen等（1998）研究发现，已知的PepT2底物可抑制谷胱甘肽的前体物Cys-Gly在星形胶质细胞中的吸收，而RT-PCR又检测到PepT2的存在。这一结果暗示，PepT2可能牵涉到CNS的抗氧化机制。
2.6 其它组织
Groneberg等（2001）研究表明，肺中的PepT2定位于肺泡的II型肺细胞、支气管上皮组织和小血管内皮组织，参与二肽、三肽和肽类药物在肺中的吸收。尽管Liang等（1995）在人的胎盘中检测到PepT1的mRNA存在，但目前对于胎盘的肽转运系统还不是很清楚。PepT1在肝脏中的表达很少，在猪、绵羊和大鼠等动物的肝脏中甚至没有表达。
3 小肽转运载体活性的调控
目前，对小肽转运载体活性的调控研究主要集中在对小肠的PepT1上，而对PepT2的研究并不多。
PepT1的表达及其活性可以被许多因素所调控，包括底物和动物年龄、发育、营养水平、激素、昼夜节律等。这些因素对其活性的上调和下调作用主要通过三条途径来实现：第一，通过pH值的变化来改变顶端的质子动力势；第二，动用囊泡贮存的小肽转运载体使其定位于肠黏膜上；第三，改变基因及其mRNA的转录和稳定性。
3.1 底物
小肽转运载体主要转运二肽和三肽，而这些寡肽底物无疑会对其活性有所影响。Thamotharan等（1998）用人的小肠Caco-2细胞作模型，研究了单个寡肽对PepT1的活性调控。结果发现，用10 mmol/l的Gly-Sar处理后的24 h，细胞顶膜的肽转运载体数量增加，而Western印迹法分析表明，PepT1的蛋白表达水平增加了两倍。当用游离的甘氨酸和肌氨酸代替时，则无效果。
虽然Gly-Sar常作为测定小肽转运载体功能表达的底物，但由于不是天然的二肽，故不具有代表性。为此，Walker等（1998）用Gly-Gln做了类似的试验，结果表明，PepT1的细胞mRNA水平和膜上蛋白的表达都大约增加了两倍。
因此，无论是天然的还是化学合成的二肽都能通过调控小肽转运载体的基因表达来影响其活性。两种可能的作用机制是：①增加mRNA编码基因的稳定性；②通过刺激启动子的转活来增加基因的转录，而这种转活似乎与启动子的氨基酸应答元件有关。
3.2 动物年龄和发育
动物在成长发育阶段，其肠道消化系统将经历两次结构和功能的改变，分别在出生或孵化阶段和哺乳动物的断奶期。而为了适应这一变化，肠道的小肽转运载体的表达和活性也会发生相应的转变。许多试验表明，在动物的胚胎期，PepT1已有表达，到出生后水平逐渐升高；此后随年龄和个体发育迅速降低，但哺乳动物在断奶后PepT1表达水平会有短暂的回升。而肾脏中的PepT1和PepT2的表达水平会稳步上升，并在出生后两周达到最大值。
Chen等（2001）研究发现，肉鸡从胚胎期的第18 d到孵化日，小肠中的PepT1的mRNA丰度迅速增加。Van等（2005）研究发现，火鸡从孵化前5 d到孵化时，小肠组织中的PepT1的mRNA增加了3.2倍。Shen等（2001）报道，大鼠肠道PepT1的mRNA和蛋白质水平从出生前17 d到出生后75 d表现出有规律的变化；在出生后，十二指肠、空肠、回肠的PepT1的mRNA迅速增加，并在第3~5 d达到最大，然后迅速减少，但第24 d(在断奶时)又出现短暂的增加，特别是在回肠；成年大鼠PepT1的蛋白水平只有先前观察到的70%。分析认为，小肠PepT1的表达在产后被诱导，可能是通过哺乳实现的，而断奶后的短暂反弹可能是一种适应机制；但也有不一致的报道，Rome等（2002）发现，大鼠小肠PepT1的表达水平在出生后的第4~50 d都没有变化。
那么，在动物的不同发育阶段，诱导小肽转运载体表达的因素究竟有哪些呢？Thiesen等（2001）认为，内部和外部信号可能直接调控小肠小肽转运载体的活性，日粮蛋白和一些神经激素（甲状腺素、糖皮质激素、胰岛素等）可能参与了PepT1在发育阶段的表达调控。
3.3 营养水平
日粮的蛋白质水平可能是影响PepT1活性的最重要因素，起着上调作用。Shiraga等（1999）研究了日粮调控小肽转运载体活性的细胞和分子机制。结果表明，当含高水平蛋白质的日粮进入消化道后，迅速被胃肠道的蛋白酶降解，使二肽、三肽和氨基酸在肠腔里的浓度增加。而这些产物（选择性氨基酸如Phe、Arg和Lys，二肽如Gly-Sar、Gly-Phe、Lys-Phe和Asp-Lys）可作为信号激活PepT1基因的转录，使其活性增强，进而使PepT1在刷状缘膜上的表达增多。最终结果是增加了对小肽的转运，这可看作是小肠对高蛋白日粮的适应性自我调节。而Ogihara等（2004）发现，日粮中氨基酸的给予会减少大鼠小肠中小肽转运载体的数量，从而降低转运活性。
此外，营养不良也将显著影响动物对小肽的吸收。短期和长期的禁食都能上调小肠PepT1的活性表达，特别以小肠中段和上段最显著。
Ihara等（2000）研究发现，饥饿、半饥饿和静脉营养状态下大鼠的小肠黏膜重量减少，而PepT1 mRNA水平增加近两倍，其蛋白水平也相应提高。分析认为，动物在饥饿时，小肠的萎缩使可吸收表面积减少，在生理上为了平衡这一变化，小肠PepT1 mRNA和蛋白水平增加，使肠黏膜刷状缘膜上PepT1的数量增加，导致小肽的吸收不会减少。Shimakura等（2006）进一步发现，禁食诱导的小肠PepT1的mRNA水平的显著提高是由过氧化物酶体增生物激活受体（PPARα）介导的，从而调控小肠氮的吸收。
3.4 激素
3.4.1 甲状腺激素
D■ring等（2005）研究发现，甲状腺机能减退将导致肾脏中总的PepT2的mRNA水平增加，这意味着甲状腺素对PepT2有着一定的抑制作用。Ashida等（2002）用T3处理Caco-2细胞，发现T3抑制了[14C]Gly-Sar的吸收，并呈现时间和剂量依赖性。与对照组相比，PepT1的mRNA和蛋白数量都显著减少，分别为25%和70%，这可能是T3使PepT1的mRNA的转录和（或）稳定性下降。
尽管目前还没有发现甲状腺激素效应元件（TRE）在大鼠和小鼠PepT1基因的启动子区域内存在。但是，当甲状腺激素进入细胞核后，可与细胞核靶基因调节区域的TRE相互作用，形成甲状腺受体复合物，可能间接地影响其转录。
3.4.2 胰岛素
Thamotharan等（1999）用生理浓度的胰岛素处理Caco-2细胞，尽管60 min内PepT1的mRNA水平无变化，但二肽摄取的最大速度却增加2倍，且刺激作用发生快。尽管胰岛素不能使PepT1的合成增加，但当其与受体结合后，可以动员胞浆池中贮存的PepT1，并使之定位于膜上，从而增加PepT1蛋白的数量，也就增加了对小肽的转运。Nielsen等（2003）进一步发现，循环中的胰岛素是通过与小肠黏膜细胞基底外侧膜上的受体结合来调控小肽的转运，当胰岛素接触顶膜时，对小肽在顶端的吸收没有影响。
3.4.3 表皮生长因子（EGF）
Nielsen等（2001）用生理浓度的EGF培养Caco-2细胞，5 d后出现抑制作用，15 d后达到最大抑制作用。尽管Caco-2细胞的顶膜和基底外侧膜都有EGF的受体，但只有暴露在基底外侧膜的EGF才能抑制二肽的转运。分析认为，EGF可使PepT1的mRNA转录水平下降，导致PepT1的数量减少，从而减少了对小肽的转运。Bravo等（2004）研究表明，用EGF对大鼠肾近曲小管的SKPT细胞处理后，PepT2的转运能力和表达呈剂量依赖性的减少。这一抑制作用可能是通过降低其基因的转录或者减少其mRNA的稳定性来实现的。
然而，EGF对小肽吸收的抑制作用也有相反的报道。Nielsen等（2003）又将Caco-2细胞的基底外侧膜短期暴露于EGF，5 min后顶端二肽的吸收却呈现出剂量依赖性的增加，产生这一结果的具体原因尚不清楚。
3.4.4 瘦素
Buyse等（2001）用Caco-2细胞研究了瘦素（Leptin）对刺激肽吸收的作用机制。30 min内，Leptin增加了二肽和肽类抗生素在Caco-2细胞中的转运，但这一结果仅当Leptin加入到细胞顶端，而不是基底外侧时才被观察到。动力学的分析排除了Leptin通过对PepT1的内在修饰来调控其活性的可能性，真正原因是Leptin与胰岛素属于同一种调控机制。
3.5 昼夜节律
Pan等(2001)研究表明，小肠PepT1的蛋白活性和mRNA的表达是随着昼夜更替而变化的。随后，Pan等（2002）通过对大鼠进行12 h（8:00~20:00）的光照，并让其自由采食，来研究肽转运的昼夜节律性。结果表明，小肠的PepT1的mRNA和蛋白的丰度在16:00~24:00时更高，[14C]Gly-Sar在24:00时的吸收速度要显著快于12:00时。然而，肾脏中的PepT1的 mRNA和蛋白水平几乎没有昼夜节律性。
Pan等（2003）在禁食和非禁食两种条件下研究大鼠小肠PepT1的昼夜节律。结果发现，饲喂组和禁食1 d组都有显著的昼夜节律性；然而，禁食2 d后，节律性消失。分析认为，由于大鼠PepT1的启动子区域存在着肝细胞核因子（HNF-1）的潜在位点，可能同依赖Na+的葡萄糖转运载体一样，HNF-1的周期性改变与这一转录水平上的调控有关。
此外，还可能与摄食和神经内分泌机制有关。像大鼠这样的啮齿类动物有着夜间摄食的习惯，作为一种日常机制，增加PepT1的活性可以为体内营养素的吸收做准备。研究证实，在16:00时，肠内PepT1的mRNA水平已经开始提高。另外，摄食作为一种肠腔活动的信号，能够刺激某些激素（如胰岛素）的分泌，进而对PepT1进行调控。Pan等（2004）也认为，摄食而不是昼夜循环能够极大地影响PepT1表达的昼夜节律。
3.6 药理学试剂
某些药理学试剂能影响小肠中小肽转运载体的活性，进而影响小肽和肽类药物的转运。但这一类物质作用的分子机制有些目前还不是很清楚，如果能够阐明的话，将对人和动物某些疾病的治疗起着重要的作用。
Berlioz等（1999）研究发现，给大鼠服用可乐定（α2肾上腺素能受体激活剂）后，β-内酰胺类抗生素在小肠的吸收增加了两倍。原来可乐定可增加Caco-2细胞顶膜上的PepT1的数量，其作用机制和胰岛素一样。Tanaka等（1998）研究发现，给大鼠服用5-氟尿嘧啶（抗癌药）3 d后，刷状缘膜囊中的二肽转运没有显著差异。但是，PepT1的基因表达水平却增加了两倍。这暗示，PepT1 通过合成的增加，来抵抗由5-氟尿嘧啶引起的肠道细胞损伤，从而保证小肠内的肽吸收不受影响。Motohashi等（2001）研究了用两种免疫抑制剂他克莫司和环孢霉素处理Caco-2细胞后Gly-Sar的转运情况，结果都降低了PepT1的活性和二肽的跨细胞转运。虽然这一作用机制还不清楚，但PepT1 mRNA水平的下降可能与此无关。此外，脂多糖（LPS）也可使大鼠空肠和回肠的PepT1的mRNA丰度下降，蛋白表达减少。但当注射地塞米松后，LPS的作用被削弱。原因是LPS可使TNF-α和IL-1β等细胞因子增加，而地塞米松可减少它们的生成（Shu等，2002）。
3.7 PKA和PKC
小肽转运载体的蛋白质结构上存在着cAMP（环磷酸腺苷）依赖性的PKA和PKC的磷酸化位点，通过这些位点的可逆磷酸化调控载体的转运活性。
Fei等(1994)研究发现，提高细胞内cAMP的水平可以降低兔的PepT1蛋白的活性，抑制小肽的转运。Brandsch等（1994）研究表明，巴豆油酯对PKC的激活可使Caco-2细胞内的二肽转运受到抑制。Harcouet 等（1997）研究发现，胞内Ca2+浓度的增加使PKC活化，进而导致二肽的吸收减少。而Chen等（2002）报道，星状孢子体（PKC抑制剂）可以显著增加PepT1的转运活性。
因此，PKA和PKC的抑制剂能显著提高PepT1的转运活性，而激活因子能降低PepT1的转运活性。通过磷酸化或去磷酸化的翻译后修饰来调控PepT1是可能的，PepT1的活性与PKC 细胞信号系统直接相关，其磷酸化位点的改变导致了活性的抑制。
4 结语和展望
对小肽转运载体（PepT1和PepT2）的成功克隆表达，并对其分子结构、组织分布和功能的初步了解，为小肽营养的深入研究开辟了一个广阔的空间。深入探讨影响其转运活性的因素及其作用机制，可以更好地应用其独特的生物学功能，在生理和临床上都有着重要意义。比如，可以通过增加小肽转运载体的表达来提高普通临床状况下（如感染和高血压等）药物理疗的效果；而对于患糖尿病和感染性腹泻的病人，肠内需要的蛋白质营养应以二肽而不是氨基酸形式来提供氮源。在药理学上，小肽转运载体作为一种有效的药物运输途径，为以后的药物设计、药物运输和药物动力学提供了新的思路。
总的来说，虽然小肽转运载体的研究已取得了初步的成就，但仍有不少工作要完成。其蛋白质分子的二级、三级结构及其功能的关系需要进一步阐明。最近研究发现了某些非肽类物质（比如ω-氨基脂肪酸和δ-氨基乙酰丙酸等），尽管它们并没有任何肽键，但也是PepT1和PepT2转运的底物。此外，虽然对于小肽转运载体活性的调控因素已有了大量的研究，但其分子和转录水平上的调控依然不是很清楚。PepT1和PepT2仅仅是POT家族的两个成员，已发现的肾基底外侧膜和小肠基底外侧膜的肽转运系统都与这两者截然不同，其它的家族成员对（小）寡肽的转运目前也不清楚，需要进一步研究。
（参考文献61篇，刊略，需者可函索）