有几个变量会影响淘选过程中的选择严格程度。根据所研究的相互作用的不同，调整选择或洗脱的强度对获得结合肽共有序列是必需的。 1. 去污剂：在结合或清洗Buffer中添加去污剂（通常是Tween-20）能降低噬菌体与靶分子和/或封阻试剂BSA之间的非特异性相互作用。最初几轮淘选中用较低浓度的Tween会增加洗脱物滴度，然后每轮逐渐增加Tween浓度（最大可到0.5%）来逐步提高选择的严格性。然而，在同步实验中，我们用0.5%恒定Tween浓度和逐步增加的Tween浓度（0.1, 0.3, 0.5%）分别进行三轮淘选，获得了相同的共有序列。当所研究的相互作用特异性比较强，以至于最初几轮淘选洗脱物的滴度（即：可结合序列的数目）可能会非常低时，建议初始几轮淘选使用较低的Tween浓度。 2. 温度：根据所研究的结合相互作用是焓驱动还是熵驱动，可以通过提高结合步骤的温度来分别增加和降低选择的强度。建议试用的结合温度为：4℃、室温和37℃。温度可以高至55℃而不失活噬菌体。 3. 结合和洗脱时间：结合时间短，易于筛选到快速结合（kon）的小肽；相反，洗脱时间长，容易筛选到解离速度（koff）慢的小肽。由于小肽结合到靶分子上的结合平衡常数ka等于kon /koff，那么，就可以通过缩短结合时间和延长洗脱时间的方式来提高筛选的严格度。在最后几轮淘选试验中，洗脱可以在两个阶段进行：在短时间内洗脱的噬菌体抛弃，长时间洗脱下来的噬菌体进行下一轮淘选或铺板。如果用pH 2.2的甘氨酸缓冲液洗脱，时间不要长于10 min，否则噬菌体的感染性会降低。 4. 靶分子的浓度：如果在液相中对靶分子进行淘选，可以通过降低靶分子的浓度来提高淘选的严格程度 (23)。建议用10 nM的初始靶分子浓度，在最后几轮筛选纳摩尔级亲和力配体时也可将浓度降低到1 nM。 5. 淘选轮数：每经一轮淘选扩增试验，就会使能与靶分子结合的肽序列在噬菌体库中得到 富集。保持每轮的噬菌体加入浓度相同，就会使展示特定结合序列的病毒子在库中的含量逐步增加，直到大多数或所有洗脱粒子都会展示一个共有序列。根据所研究的相互作用和所施加的筛选严格度的不同，通常会在2-3轮淘选后能达到这种情况。如果3轮淘选后也没有明显的共有序列发现，则第三轮的洗脱物应当继续扩增进行第四轮淘选试验。 6. 文库的选择：如果三或四轮淘选后，仍没有明显的配体共有序列发现（或者所有的噬菌斑都呈白色），可能就是所用文库中不含有能与靶分子紧密结合的序列克隆。对这种现象的解释是：统计上理想配体序列太少或不存在（不具代表性）（见21-22页）；或者，肽分子不能以足够强的亲和力与靶分子结合而被筛选，这种情况下用Ph.D.-C7C文库会更好一些，此文库中，所有展示肽结构均被局限于一个7-残基二硫loop环内，其结合构象比以线性形式表达的肽文库更有效、结合更紧密（由于结合熵得到改善）；最后，如果配体仅要求在一个短的区域内有几个结合位点，那么Ph.D.-7肽文库可能是一个更好的选择。由于十二肽库提供了更大的随机区域，就会有利于选择到有多个弱结合位点的序列，而不是只有少数几个强结合位点的序列。这时，Ph.D.-7肽文库可能更有利于共有序列的出现。然而遗憾的是，在缺乏靶分子-配体相互作用的详细结构信息时，是不可能预测哪一种文库能产生最好的结合配体的。