[摘要] 肽类药物的研究开发成为新生物技术药物研究开发的热点之一。然而，建立可靠、灵敏和准确的肽类药物体内分析方法是肽类药物II占床前和临床药动学研究的难点。样品制备技术是建立符合药动学研究要求的定量分析方法的关键。现综述液质联用技术在肽类药物药动学研究中的样品制备技术方法的目的、要求、特点和分类。结合近年发表的文献具体阐述了固相萃取法、蛋白质沉淀法、超滤离心法、亲和层析法和部分其他方法的原理及其应用实例。[关键词] 液质联用；肽类药物；药动学；样品制备Sample preparation by using LC-M S in pharmacokinetic studies of polypeptide drugsDAI Shu-jia，TANG Zhong-ming，QIAN Xiao-hong(Institute Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China)[Abstract] The discovery of new polypeptide drugs is becoming one of the most favorable topics in the biotechnological medicine．It is considered as hard cores tO develop reliable and sensitive quantitative analysis in vivo，as well as the sample preparation technology，of polypeptide drugs for the preclinical and clinical pharmacokinetic studies．This paper reviews the objectives，requirements，classification and characteristics of sample preparations by using liquid chromatography tandem mas spectrometry (LC-MS)in pharmacokinetic studies of polypeptide drugs．It also introduces the principles and applications of variety of sample preparation methods including solid phase extraction，protein precipitation，ultra—filtered centrifugation and affinity chromatography．[Key words] liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS)；polypeptide drugs；pharmacokinetics；sample preparation多肽是生物体内重要的生命物质之一，随着肽合成技术和以噬菌体展示技术为代表的肽库技术的推广，大量候选多肽药物应运而生。目前，国内外已有上百种多肽类药物进入临床前评价、临床试验或应用阶段。然而建立可靠、灵敏和准确的肽类药物体内分析方法是肽类药物临床前和临床研究评价的难点和关键。该类研究主要采用同位素标记结合色谱分离法、免疫测定法和生物检定法_，但上述各方法在精确区分和指认药物原形和代谢物等结构相关信息方面体现了一定的局限性。对此，国内外均做了相对全面的比较和综述。在过去的十多年中，随着基质辅助激光解吸附电离和电喷雾电离接口技术的飞速发展，生物质谱与多种高效的分离手段特别是高效液相色谱的联用(LC-MS)技术成为复杂组分中生物大分子定性、定量分析的有力工具_5 J。近年国外已有部分液质联用技术应用于肽类药物定量分析的研究论文发表。John等总结建立复杂生物样品的肽类物质分析方法中，各类研究的焦点主要集中在样品制备技术、内标物选择和质谱装置与检测模式的选择这2个方面。最近，Ji等首次提出了基于LC-MS定量分析生物样品中相对分子质量较低的蛋白质、多肽药物的策略，并指出阻碍该策略广泛应用于体内蛋白质定量分析的瓶颈主要是生物样品制备技术的问题。现结合国外文献重点综述LC-MS在多肽类药物药动学研究中的各种样品制备方法的目的要求、分类、原理及其应用，希望为国内顺利开展相关研究提供参考。1 LC．MS用于肽类药物样品制备的目的、要求、特点及分类药动学定量分析的特点要求在尽量短的时间内准确分析尽可能多的样品。所以，该类研究的生物样品制备总体趋势是尽可能采用高通量的自动化或半自动化处理手段进行。但是，肽类药物的结构、组成、性质与生物基质含有的大量蛋白质和多肽相似甚至相同，故其样品制备过程较合成的小分子药物有所不同，通常要求方法具有更高的灵敏度和选择性。肽类样品制备方法区别于传统的小分子合成药物，因为被分析物无论是组成和结构，还是理化性质均与生物样品的基质蛋白质或多肽相同，这为该类药物的提取、分离和鉴定分析工作带来了极大的挑战。目前文献报道的各类技术中，根据操作方式的不同，生物样品制备方法可分为离线模式(offline mode)和在线模式(online mode)两种；根据方法原理不同，可大致分为特异性和非特异性方法两大类。前者主要指亲和层析法(affinity chromatography，AC)；后者包括蛋白沉质淀法(protein precipita—tion)、固相萃取法(solid phase extraction，SPE)、超滤法(ultrafiltration)、灌注色谱法(perfusion chro．matography，PC)、阻定性进入介质(restricted accessmedia，RAM)的应用等。2 常用的肽类药物样品制备技术的原理和应用由于肽类分子的物理化学性质介于小分子有机物和大分子蛋白质之间，需充分考虑肽类分子和生物基质的理化性质以选择适当的制备途径。同时，限于目前质谱技术发展的阶段，生物技术药物分析中应用最多的还是相对分子质量较小的多肽类药物。表1总结了近年应用LC．MS联用技术定量分析蛋白质、多肽类药物的部分具有代表性的研究实例。以下具体介绍几种报道较多的肽类药物样品制备方法。2．1 SPE SPE可以达到初步的去除杂质、脱盐及浓缩被分析物的目的。随着可用于SPE的材料种类的增加及方便的小型器械的商品化，SPE在小分子及多肽类物质的研究中广泛使用L1引。SPE的原理与柱层析类似，主要包含离子交换和反相色谱机制，洗涤和洗脱可用盐溶液，水、甲醇、乙腈及其不同比例的混合液，也可用环己烷等非极性溶剂洗涤，从而有效去除疏水杂质。Ji等开发了半自动的96孔板SPE提取流程，实现了对相对分子质量为10 464的蛋白质分子的血浆样品提取，且满足临床前研究的要求。文中还指出96孔板SPE形式的主要优势在于使用圆盘替代层析柱，减少了样品的洗脱体积；与自动化液相处理系统保持了良好的兼容性，从而大大提高了样品制备的通量。自动化的SPE方法结合柱切换技术，使单位临床样本的分析时间小于10 min，并且保持了粗分离和低变异。 2．2 蛋白质沉淀法 蛋白质沉淀法是一种快速的杂质蛋白质去除方法。常用的蛋白质沉淀剂包括乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等有机溶剂，高氯酸、三氯醋酸等有机酸，饱和硫酸铵等盐类物质。通常在沉淀蛋白质后离心，上清层可经挥干、重溶或不作处理直接进样LC．MS分离分析。具有操作简单，无需特殊装置等优势。然而，该方法由于沉淀剂的引入，同时产生了对色谱分离和质谱检测步骤的不利因素。首先，由于非特异性的沉淀反应可能使微量的分析物随着基质蛋白质共同沉淀而损失。其次，有机溶剂的引入可能影响后续的液相色谱分离效能，而有机酸和盐类物质则在喷雾电离过程中抑制分析物的离子化效率，大大降低检测灵敏度， Sibylle在利用乙腈沉淀血清蛋白质后发现多肽药物随着沉淀反应而有所损失；Yamaguchi等_在多肽KW-5139的定量研究中使用乙腈沉淀蛋白质后，上清层直接进样分析获得了满意的结果，同时讨论了不同pH值下分析物的多电荷离子分布情况。2．3 超滤法 选择适当相对分子质量截留的超滤管(1 000～3 000)，可以有效的实现肽类物质富集浓缩和脱盐。但在使用时需注意到药物与生物样品基质的相互作用而降低回收效率。Fierens等直接将尿样进行超滤处理，结合LC-MS成功的分析了尿中C-peptide的含量。2．4 亲和层析作为样品制备方法的亲和萃取(affinity extraction)是基于固相化亲和介质与其对应的目标分子特定结构域较强的特异性相互作用，分离复杂生物基质中特定组分的方法。亲和提取法是目前富集效率和专属性最高的样品提取、富集手段之一。但目前用于肽类药物定量分析研究的文献较少，这主要是由于免疫亲和层析和受体亲和层析等方法的建立造价较高，选择适当亲和力的抗体或配基较难以及反应条件的通用性较差等。Kobayashi等首次报道了利用免疫亲和层析技术提取人降钙素(human calcitonin，hCT)的制备方法，并用于生物样品中hCT 的提取定量分析。Ander—son等 J建立了利用稳定同位素作为内标物，利用抗特定肽段的抗体亲和层析将肽段从复杂的生物体系中提取出来的方法，称作SISCAPA(stable isotope standards and capture by anti．peptide antibodies)同时将此方法成功用于复杂样品中指定蛋白质、多肽的定量分析中。2．5 其他方法灌注色谱是近年出现的一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。制成的固相萃取柱或液相柱，可以每分钟几十毫升的高速上样，尤其在生物样品和培养基中蛋白质和肽类的分离、富集和除盐，具有独特优势。Choi等改良了传统的多步灌注色谱法(multistep perfusion chromatography，MSPC)，开发出一步灌注色谱法(single — step perfusion chromatography．SSPC)，并成功用于大鼠肝脏组织等复杂组分的蛋白质组研究中，获得了增强的多肽信号。阻定性进入介质有两层不同的表面，外层表面通过体积排除作用提供选择性，并仅允许相对分子质量较小的分子进入内表面。内层表面通过传统的分配作用捕获分析物引。选择适当填料，有望在肽类药物研究中应用。但是，上述两种方法尚未查到在复杂生物样品中蛋白质、多肽的药动学研究的报道。此外，为了适应高通量、自动化处理的要求，集成了多种分离、提取、分析模式的在线处理系统也不断的研制开发并用于复杂生物样品的研究中。在线处理系统包含了诸多符合大规模样品制备或分离的装置，一般较离线方式复杂，且成本较高。此外，由于分析目标不同，目前还没有通用和成熟的商业化系统可供应用。3 结语与展望受到日益激增的样品数量的影响，目前的样品制备技术正向着自动化、高通量和专属性强的方向发展。而选择适当的方法仍然要考虑很多因素，包括样品用量，提取方法的灵敏度、精密度、回收率、线性范围和最低检测限，合适的内标物等。越来越多的LC-MS方法被开发用于多肽类药物的生物样品分析，但由于样品分析通量和灵敏度有限，现阶段多肽类药物的临床前和临床评价仍然采用免疫学方法为主。目前小分子合成药物的评价大多采用质谱联用的分析方法，肽类药物乃至蛋白质类药物要达到这个目标尚需要包括样品制备、稳定同位素标记技术、质谱装置和专业分析软件等多方面技术的共同进步]。虽然，至今报道的使用LC-MS方法定量分析蛋白多肽类药物的最大相对分子质量也仅为10 464，且灵敏度有限，但LC-MS对药物原形分子的准确和精密的识别和定量分析是其他定量、定性技术难以比拟的。相信在不久的将来，随着分离技术和质谱检测技术的发展，基于LC-MS的快速、稳定、可靠、准确的分析方法能够广泛的应用于生物技术药物的药动学研究中。[ 参考文 献 ][1] Ryu DD，Nam DH．Recent progress in biomolecular engineering[J]．Biotechnol Prog。2000，16(1)：2—16．[2] Sehgal A．Recent developments in peptide—based cancer therapeutics[J]．Curr Opin Drug Discov Devel，2002，5(2)：245—250．[3] 汤仲明，刘秀文，柴彪新，等．蛋白多肽药动学研究的方法和实验设计[J]．中国药理学与毒理学杂志，1996，10(3)：161—168．14] Thomsen MK，Diness V，Nilsson P，et a1．Pharmacokinetics of recombinant factor Vlla in the rata comparison of bio-．immuno-and isotope assays[J]．Thromb Haemost，1993，70(3)：458—464作者：戴舒佳，汤仲明，钱小红