陈庆华　瞿文摘　要：目的：介绍多肽、蛋白质类药物缓释剂型的研究进展。方法：综述了近年来埋植剂(细棒型和可注射埋植剂)及微球注射剂(多肽微球和疫苗微球注射剂)研究与开发的品种及优缺点；介绍了两种实用的微球制备方法。结果与结论：以生物可降解聚合物为囊材的微囊化技术是开发研制控(缓)释多肽、蛋白质微球注射剂的有效的途径，且颇有发展前途。关键词：生物技术；多肽；埋植剂；微球▲　随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现。目前已有35种重要治疗药物上市，生物技术与生物制药企业的发展也日益全球化。生物技术药物研究的重点是应用DNA重组技术开发可应用于临床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等。据Parexl＇s Pharmaceutical R&D Statistical Source Book报道，目前已有723种生物技术药物正在接受FDA审评(包括Ⅰ～Ⅲ期临床及FDA评估)，700种药物处于早期研究阶段(研究与临床前)，还有200种以上药物已进入最后批准阶段(Ⅲ期临床与FDA评估)［1］。　　生物技术药物的基本剂型是冻干剂。常规制剂尽管其疗效早为临床所证实，但由于半衰期短，需要长期频繁注射给药，从患者的心理与经济负担角度看，这些都是难以接受的问题。为此，各国学者主要从两方面着手研究开发方便合理的给药途径和新制剂：①埋植剂和缓释注射剂。②非注射剂型，如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药等［2］。缓释生物技术药物的注射制剂，是很有应用前景的新剂型，有一些品种如能缓释1至3个月的黄体生成素释放激素(LHRH)类似物微球注射剂已经上市［3］，本文着重介绍这类制剂。1　多肽、蛋白质药物缓释制剂的主要类型　　多肽、蛋白质药物缓释制剂的研究与开发，从发展过程及剂型看，主要分埋植剂和微球注射剂两类。1.1　埋植剂(implant)1.1.1　细棒型埋植剂［4］　埋植剂外形为一空心微型细棒，一头封闭，另一头开口，棒材为聚四氟乙烯等非生物降解聚合物。腔内灌入药物与硅胶(silastic,聚二甲基硅氧烷)混合物。埋植剂埋入人体皮下，药物通过硅胶基质开口处缓慢释放。美国内科医生手册(PDR)上收载了商品名为Norplant?的埋植剂，药物为左旋-18乙基炔诺酮，用于计划生育。该制剂每根直径2.4 mm，长34 mm，医生通过手术将6根细棒状物埋植在患者上臂内侧，药物可在体内按零级模式释药达5年，药物释完后再经手术取出。1.1.2　微型渗透泵埋植剂　美国Alza公司20世纪70年代开发了外形像胶囊的埋植剂，该制剂埋植于皮下或其它部分，体液可渗透过外壳，溶解夹层电解层，使体积膨胀的夹层压向塑性内腔，促使药物溶液从开口定速释放。有不少生物大分子药物，如胰岛素、肝素、神经生长因子等作为模型药物的动物体内外研究报道［5］。埋植剂对需要长期用药的慢性患者的治疗具有积极的意义，但它存在以下缺陷：①必须经手术途径植入。②制剂骨架材料为非生物降解聚合物，释药结束后还需经手术取出。③制剂在局部组织有刺激与不适感。1.1.3　可注射的埋植剂　可生物降解聚合物作为埋植型或注射型缓释制剂骨架是近20年来国内外学者大力研究的方向，这类聚合物包括两大类：①天然聚合物，如明胶、葡聚糖、白蛋白、甲壳素等。②合成聚合物，如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚己内酯、聚羟丁酸等。　　近年合成聚合物尤为人们重视，PLGA于20世纪70年代起即用作外科缝线及体内埋植材料，如人工关节、护板、螺栓等。聚合物在体内可逐渐降解为乳酸、羟乙酸，后者经三羧酸循环转化为水和二氧化碳。它除具有良好的生物相容性(biocomparability)、无免疫反应、安全性较高外，更难得的是可通过改变两单体比例及聚合条件调节聚合物在体内的降解速度。近10多年来，作为微球、微囊的骨架或包衣材料的应用报道越来越多。合成聚合物理化性质稳定，控制工艺条件可得到所需规格，批间质量差异小，这些都是天然聚合物无法比拟的优点［3］。　　近年Zenica公司研制成功商品名为Zoladex的可注射埋植剂，将多肽药物戈舍瑞林(goserelin)与PLGA在熔融状态混匀后经一多孔装置挤出，挤出物直径为1 mm，经切割成一定长度的条状物，单剂量3.6 mg，灭菌后直接密封于一次性注射器内待用。该制剂可直接注射于皮下或肌内，基质在体内可逐渐降解，彻底改变了以往埋植剂必须经手术途径植入或取出的局面［4］。　　但可降解埋植剂也有自身缺陷：酸性降解产物(乳酸、羟乙酸)在埋植剂内部逐渐蓄积，多肽、蛋白质的稳定性可能会受影响，故近来研究重点转向注射微球。1.2　微球注射剂1.2.1　多肽微球注射剂　采用生物可降解聚合物，特别是PLGA为骨架材料，包裹多肽、蛋白质药物制成可注射微球剂，使在体内达到缓释目的，是近10多年来各国学者大力研究的新领域。在诸多多肽缓释注射剂中，LHRH类似物微球是研究最为成功的品种。LHRH为10个氨基酸组成的小分子多肽，分子结构为：焦谷1-组2-色3-丝4-酪5-甘6-亮7-精8-脯9-甘10-NH2，它由前下丘脑分泌后迅速由垂体门脉转运至腺垂体，调节促性腺激素(GTH)，控制性激素的合成与分泌，后者再调节性器官的生长发育。　　当外源性LHRH或其类似物以生理脉冲频率(每90 min一次)短期、小剂量给药时，对垂体性腺系统起促进作用，临床用于治疗性功能低下、不排卵、青春期延缓等症状；而以非生理脉冲频率长期、大剂量给药时，可抑制垂体分泌黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，导致性腺分泌激素能力下降，性器官萎缩，临床用于治疗一些激素依赖性疾病，如前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位及青春期性早熟等［6～7］。　　曲普瑞林(triptorelin)是LHRH类似物之一，其PLGA微球由法国Ipsen公司开发，1986年上市，可缓释1个月，是第一个多肽微球产品。　　亮丙瑞林(leuprorelin)是LHRH类似物，生物活性为LHRH的15倍。其缓释1个月的微球注射剂由日本武田化学制药公司开发，于1989年进入美国市场，随后有多种LHRH类似物缓释微球注射剂上市［8～9］，见表1。　　丙氨瑞林(LHRH-A)是上海丽珠-东风生物技术有限公司开发的国家一类新药，疗效为LHRH的15倍，上海医药工业研究院承担国家科委“九五”攻关项目，进行每月用药1次的长效微球的开发研究，动物体内试验证明其缓释效果可靠。　　其它多肽缓释微球注射剂的研究也有不少报告，见表2。 此外，也有不少用微囊化手段使胰岛素、神经生长因子、内皮生长因子、转化生长因子-β等达到缓释研究的报道。1.2.2　疫苗微球注射剂　传统的免疫手段系疫苗初次注射后，在一定时间内，需再进行多次加强注射，使人体获得尽可能高的抗体水平，发挥可靠的免疫作用，这对成千上万人的大规模免疫是难以实现的，特别对条件较差的发展中国家更为艰巨。所以，每年全世界有几百万人死于百日咳、破伤风或白喉等免疫疾病。采用微囊化技术将疫苗或佐剂包裹在可生物降解的聚合物中，一次注射后，抗原在体内连续释放数周甚至数月，由此产生持续的高抗体水平，甚至可相当于疫苗多次注射的脉冲模式释药。此种剂型称为一次性注射疫苗(single dose vaccine)，对临床免疫是一种有巨大实用意义的新剂型。表1　国外开发的LHRH及其类似物缓释注射剂　 药物 生物 半衰期 剂型 商品名 骨架 缓释时 开发公司 LHRH 亮丙瑞林 (leuprorelin) 活性 /min 材料 间/月 1 8 15 16 微球 Prostap SR， PLGA 1 Abott/武田 Enantone， 75∶25 Lucrin， Lupron， Tap-144 SR 微球 PLA 3 武田(1996年 向欧美提出 新药申请) 曲普瑞林 (triptorelin) 100 30 微球 Decapeptyl PLCG 1 Ipsen/ 50∶50 Ferring 布舍瑞林 (buserelin) 25 80 注射埋 PLCG 1 Hoechst 植剂 75∶25 高舍瑞林 (goserelin) 75 注射埋 Zoladex PLCG 1 ICI 植剂 50∶50 那法瑞林 (nafarelin) 200 144 微球 PLCA Syntex/South 50∶50 Res.Inst.(Ⅱ 期临床) 　 药物 生物 半衰期 剂型 商品名 骨架 缓释时 开发公司 LHRH 亮丙瑞林 (leuprorelin) 活性 /min 材料 间/月 1 8 15 16 微球 Prostap SR， PLGA 1 Abott/武田 Enantone， 75∶25 Lucrin， Lupron， Tap-144 SR 微球 PLA 3 武田(1996年 向欧美提出 新药申请) 曲普瑞林 (triptorelin) 100 30 微球 Decapeptyl PLCG 1 Ipsen/ 50∶50 Ferring 布舍瑞林 (buserelin) 25 80 注射埋 PLCG 1 Hoechst 植剂 75∶25 高舍瑞林 (goserelin) 75 注射埋 Zoladex PLCG 1 ICI 植剂 50∶50 那法瑞林 (nafarelin) 200 144 微球 PLCA Syntex/South 50∶50 Res.Inst.(Ⅱ 期临床) 表2　研究中的多肽、蛋白质药物微球注射剂 药物 适应证 剂型 骨架 研究进展 参考 　 　 　 材料 　 文献 促红细胞生成 肾功能不全 微球 PLGA 体外缓释 1 素(EPO) 贫血 　 50∶50 2周 γ-干扰素 肉芽瘤 微球 PLGA 体外缓释 10 (rhIFN-γ) 　 　 50∶50 7 d 白介素(IL-α) 肿瘤免疫 微球 PLGA 动物体内 11 治疗 　 50∶50 缓释7 d 　 　 75∶25 人粒细胞巨噬细 骨髓移植 微球 PLGA 动物体内 12 胞集落刺激因子 　 　 50∶50 缓释9 d (GM-CSF) 人生长激素 生长不良 微球 PLGA 动物体内 13 (rhGH) 肾功能不全 　 50∶50 缓释30 d 14 生长抑素 生长激素分 注射埋 PLGA 动物体内 15 (somatostatin) 泌亢进 植剂 50∶50 缓释250d 第一个被WHO批准的一次性注射疫苗是破伤风类毒素(tetannstoxoid，TT)微球注射剂。采用PLGA将TT油溶液包在微球内，注射剂中含两类微球，一类囊材为50∶50的PLAG，微球直径较小(1～15 μm)，含较高量TT(142 ng.mg-1)，这种粒径的微球易为巨噬细胞吞噬；后者采用75∶25的PLGA制成直径10～60 μm的微球，内含较低量TT(3 ng.mg-1)，速释部分发生在微球注射后的突释效应(burst effect)期内，第二释放相发生在注射后3～11周。实验表明这种脉冲释药模式与用水溶性TT免疫相比，可使小鼠获得更高的抗毒素抗体水平。其它一次性注射疫苗的研究进展见表3。 表3　研究中的一次性注射疫苗微球［16］　 抗原 微球骨架材料 粒径/μm 体内释药模式 动物及用药途径 BSA 乙烯醋酸乙 0.3 初始突释，以后 小鼠皮下埋植 酯(EVAC) 　 连续释药 γ-核糖核 EVAC 0.3 初始突释，以后 兔皮下埋植 酸酶A 　 　 连续释药 BSA EVAC 　 初始突释，以后 兔皮下埋植 　 　 连续释药 BSA 聚TTH-亚氨 0.5克微球(内 连续释药后期 小鼠皮下埋植 基碳酸盐 含BSA 50mg) 减慢 卵清蛋白 PLGA50∶50 5.34 　 小鼠腹腔注射 34 kDa SEB PLGA 1～10 　 小鼠腹腔注射 50∶50 20～50 白喉类毒素 PLA 30～100 初始突释，以 小鼠气管滴注至 49kDa 　 后连续释药 肺、皮下注入 MN-rgp120 PLGA 20～100 脉冲释药 豚鼠皮下注入 HSD白喉 PLGA 65∶35 5～90 连续释药 大鼠、猴肌注 类毒素 PLA MN-rgp120 PLGA 50∶50 0.37～0.50 　 小鼠皮下、肌注 34kDa 　 　 及鼻腔用药 各种多肽 PLGA 0.45～0.60 　 小鼠腹腔、肌内 抗原 50∶50 1.21～3.20 　 注射 　 6.24～32.1 　注：BSA：牛血清白蛋白；SEB：葡萄球菌肠毒素β类毒素；MN-rgp120：人免疫缺陷病毒(HIV-1)预防疫苗的蛋白亚单位 2　微球的制备方法　　有多种注射微球的制备方法，如相分离法、复乳-液中干燥法、喷雾干燥法、低温喷雾提取法、熔融-挤出法等，以下着重介绍最常用的两种方法。2.1　复乳-液中干燥法(w/o/w -liquid drying process)　　将生物可降解聚合物，如PLGA溶解在有机溶媒(二氯甲烷或醋酸乙酯)中，水相中加入定量的多肽成溶液或混悬液。将水相加入上述有机相中，匀化或超声振荡成初乳(w/o)，初乳再转入含PVA的水溶液中，搅拌成复乳(w/o/w)，升高系统温度，除去有机溶媒，固液分离后，干燥待用。2.2　低温喷雾提取法(cryogenic process)　　将多肽及其稳定剂的粉末或冻干品和生物可降解聚合物的二氯甲烷溶液均匀混合，混悬液经一喷头以雾状喷至冰冻的乙醇溶液中，后者界面封以液氮。在-70℃温度下，乙醇将微球中二氯甲烷不断抽提，经过滤去除乙醇，得流动性佳的微球，干燥待用。　　复乳法是目前制备多肽微球最常用的方法，它具有工艺稳定、设备简单等特点。比较复乳法与低温喷雾法，前者制备的微球突释效应常达15%～35%，而用低温喷雾法制备的微球可明显改善上述缺点，而且据报道药物包裹率可达100%，国外已有从实验室到中试规模的设备［14］。3　小　结　　用微囊化技术制备多肽、蛋白质药物可注射微球是生物技术药物推广、应用十分重要的方向，可注射微球剂除具有可靠的缓释效果外，由于其骨架材料的可生物降解性，改善了埋植剂必须经手术途径植入与取出、局部刺激性与不适等问题。　　生物可降解聚合物作为微球骨架是必不可少的材料，国内这类聚合物开发技术已有较好的基础，但多规格产品的开发、体内行为(代谢、毒性)的研究还很薄弱，有待加速进行，使其能早日通过临床应用审评并实现产业化。　　需要指出的是，不是所有的多肽、蛋白质药物都应当制成缓释剂型。除了考虑药物半衰期、稳定性和理化特性等因素外，应根据正常的人体生理规律选择剂型及释药模式。　　微球的突释效应是此剂型存在的难题，它除与载体特性有关外，工艺也是重要的影响因素，本文介绍的复乳-液中干燥法与低温喷雾法是较有应用价值的工艺。■作者单位：陈庆华(上海医药工业研究院，上海，200437 )　　　　　瞿文(上海医药工业研究院，上海，200437 )参考文献：［1］吴梧桐.下一个10年的生物技术与生物制药.中国药学杂志，1999，34(1)：3.［2］陈庆华，瞿文.多肽、蛋白质药物的微球给药系统研究进展.国外医学.药学分册，1997，24(30)：129.［3］Kada H.One-and three-month release injectable microspheres of the LHRH superagonist leuprorelin acetate.Adv Drug Deli Rev,1997,28:43.［4］Physician?s Desk Reference 49th.Medical Economics,1997：2564；2638.［5］Johson 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