反相高效液相色谱／电喷雾质谱法分析化学合成七肽粗产物王贤纯　 梁宋平　(湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081) 摘 要 利用 RP—HPLC／ESI—MS直接分析用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成方法在 PHB树脂上偶联合成的一个七肽 (H2N—Tyr—Vla—Asn-Thr-Asn—Met—Gly—COOH，Mr　797．3)粗产物。RP．HPLC显示合成粗产物含有 1个主成分 ，4个次要成分和多个微量成分；与之联用的电喷雾质谱则同步准确地测定出各成分的分子量 (m／z)并自动对各主要成分的化学结构进行了串联质谱分析。结果证明，粗产物中的主成分即为目标七肽，另外几个主要副产物为七肽的氧化产物或残缺肽 。　 关键词 色谱-质谱，多肽，固相化学合成　 1　 引　 言　相化学合成技术可以迅速有效地制备各种模式多肽和天然多肽的类似物 ，广泛用于蛋白质多肽的结构与功能研究和药理学研究等¨l2　J。然而，化学合成多肽时往往伴随有一系列副反应 ，不仅影响合成产物的纯度 ，而且还可能影响到 目标产物的真实性 ，所以需要采用有效的方式对合成产物进行分离和鉴定 ，并对副反应机制进行探讨 ，为改进合成条件，减少副反应 ，提高合成产物纯度提供参考依据。上世纪末发展起来的基于“软”电离技术和碰撞诱导裂解 (CID)技术的生物质谱可以在 pmol水平对合成产物进行快捷的分子量测定和化学结构分析　J，与高效液相色谱技术联用后更加有力地推动了化学合成多肽的鉴定和副反应机理的研究。到 目前为止 ，已有包括氧化、酰化和异常断裂在内的多种副反应机制得到阐明 。本实验利用反相高效液相色谱．离子阱电喷雾 串联质谱联用技术直接分析固相化学合成七肽粗产物，一次性鉴定出目标肽及其 4个主要副产物的化学结构，讨论了色谱，质谱联用技术在固相多肽合成研究中的应用和副产物形成的可能机制。　 2　 实验部分　 2．1 仪 器　 1　100型高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)；Esquire—LC型离子阱电喷雾质谱仪(美 国 Bruker　Da1．tonics公 司)。　 2．2 样 品与试 剂　 七肽为本实验室参照文献 [1O]的方法手工固相合成。三氟乙酸(TFA)购 自 Eastman公 司；乙腈 (ACN)和冰醋酸分别为国产色谱纯和分析纯试剂。　 2．3 实验方法　 化学合成七肽粗产物的分析在反相高效液相色谱 (RP．HPLC)和与之联用的电喷雾串联质谱仪 (ESI—MS／MS)上进行。合成粗产物 的水溶液超滤(0．22　Ixm)后直接用于分析。RP．HPLC分析中采用C8柱(4．6　mm×150　mill，美国 Agilent公司)。洗脱液 A为 0．02％ TFA；洗脱液 B为含 0．02％ TFA的ACN。洗脱梯度为：O一5　min，10％ B；5—10　min，15％ B；10—30　min，25％ B。流速 0．5　mL／min。214am检测。开始洗脱约 5．5　min后再将流出液直接引人质谱仪离子源 ，以减少对质谱离子源的污染。质谱分析主要参数 ：正离子模式 ，自动 MS／MS，碎裂电压为 1．0　V；喷雾压力为 5O　psi(3．45×10　Pa)；干燥气(N　)流速为 10．0　L／min，温度为 350￣C，碰撞气为氦气。质谱分析结果借助仪器附带的 Bruker　Data．Analysis软件进行处理 。 3 结果与讨论　 3．1　 RP-肿 LC分 离和成 分分子量的在线检测合成粗产物的 RP．HPLC图 1A显示 ，样品中含有 1个主成分、4个次要成分及多个微量成分 ；图 1B为相应的质谱分析总离子色谱图(TIC)(RP—HPLC开始洗脱 5　min后才与质谱离子源连接 ，故 TIC信号接受滞后于 HPLC约 5．5　min)。信号离子峰上的标注数值为通过软件处理后获知的各成分的 m／z，可见质谱方法可检测出 HPLC利用紫外吸收法不能检测到的若干微量成分。样品中主成分的 m／z值为798．3，与七肽理论分子量 [M+H]　 798．3相同，提示样品中的主成分即为 目标七肽 ，其它成分为副产物。几个含量较高的副产物的存在 ，说明在手工操作合成该七肽时某些不利的因素明显干扰了多肽的正常合成。虽然可根据副产物分子量的变化和与 目标肽 比较的相对保 留时间，对它们的性质(如疏水性变化等)作出一些推断，但与 目标肽的最终确定一样 ，还需要收集其他的结构信息加以证实recording　was　delayed　for　about　5．5　min，the　values　in　parentheses　weer　m／z　of　the　components)。　 3．2 串联质谱分 析　 在分析过程中，质谱仪 自动对来 自HPLC的洗脱成分交替进行一级质谱(MS)和二级质谱(MS　)处理。借助分析软件，获得了主成分(m／z为 798．3)和4个副产物(m／z分别为814．2、741．3、610．3和417．1)化学结构较完整的信息。其它微量成分(如 m／z分别为 569．5和 632．2的2个成分)，由于含量太低，在本实验条件下获得的 MS　图中碎片离子峰太少和太弱，不足以用来解析这些微量成分的化学结构。　 3．2．1 主成分的结构鉴定 主成分的 MS／MS分析结果见图2。图中有主成分分子离子经 CID过程产生的一系列碎片离子 ，其中丰度较大的为肽键断裂后电荷保 留于 Ⅳ一端形成 的 b系列碎片离子 b　～b，同时还可观察到肽键断裂后 电荷保留于 C-端形成的部分 Y系列碎片离子 Y　～Y。可以确定主成分的氨基 酸序列为 H2N—Tyr-Val-Asn-Thr-Asn—Met-Gly-COOH，即为 目标七 肽。　 3．2．2 副产物的结构鉴定　 (1)814．2成分　 由于合成七肽的真实性 已经确定 ，所以利用 MS／MS数据鉴定副产物结构时用与七肽序列对 比的方式进行。从分子量推断 ，m／z为 814．2的成分是七肽氧化所致 (798．3+16=814．3)，而最可能被氧化的氨基酸残基是 Met和 Tyr。MS／MS分析结果 (图 3)显示 ， 814．3成分经 CID过程裂解后 的碎片离子中有 b　b4、b　b6+16(739．0)、b7+16(796．3)和 Y　+16 (336．7)、Y　+16(437．8)、Y　+16(551．8)，证实 814．2成分是七肽的第 6位 Met(Met。)残基被氧化的结果。Met　氧化后很可能生成了甲硫氨酸亚砜类物质 ，而手工合成多肽的过程中洗涤树脂时采用抽气过滤的方式可能是造成氧化的主要原因，提示合成序列中有易氧化的氨基酸残基存在时，应采用惰性气体吹滤和避光操作等防氧化措施。(2)741．3和 610．3成分 m／z分别为 741．3和 610．3的两种成分从分子量推断分别为七肽丢失 C．端 Gly(798．3—57．0=741．3)或 Met．Gly(798．3—131．0—57．0=610．3)后形 成 的“残缺肽 ”。图 4为 741．3成分 的 MS／MS分析结果 ，从 图 4A中可观察 到明显的七肽 的 b～b系列离子 ，没有七肽的 Y　系列离子 ，但有 Y　一57．0(364．7)，Y　一57．0(479．2)和 Y6—57．0(578．3)离子 ，证明 741．3成分是 目标七肽缺失 C-端 Gly后生成。而 610．3成分的 MS／MS图(图略)中可观察到明显的七肽 的 b　～b　系列离子和 Y　一188离子 ，证 明它确 为七肽缺 失 C一端 Met—Gly所致 。(3)417．1成分417．1成分 的 MS／MS分 析结 果 见 图 5。结 合 其分 子量 分析 ，该 成分 为 三肽 H　N—Tyr—Val—Asn—COOH ，417．1是该三肽的 Na　加合离子(即 M+Na　)的 m／z。MS／MS图中有该三肽 的 b　、b”Y，，_H　+Na (155．1)、Y　(232．0)和 Y　(395．1，即 M+H　)等离子峰存在也印证了这一结构。已获结构鉴定的 4个副产物中有 3个为七肽丢失一个或多个氨基酸残基后的“残缺肽”。推测是偶联合成结束后用裂解试剂从树脂上切割多肽时 ，部分肽一树脂 的切点发生了异常，造成部分肽键断裂，这可能与裂解操作条件 (如环境温度和裂解时间等)控制不当有关。 通常可用高效液相色谱方法将化学合成多肽的副产物与目标肽分离 ，但仅能提供有限的副产物化学结构的信息 ，难以对副反应的机制作 出合理的推断。而基于 Edman降解的多钛序列分析方法虽然测序结果 比较准确 ，但成本高、耗时长 ，不可能对每一个合成多肽及其副产物都进行序列分析 ，而且这种序列分析方法对许多修饰残基也不能作出确切的鉴定。由于基质辅助激光解吸／电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)技术在质谱中的应用，不仅可以一次性测定合成粗产物中各成分的分子量，而且可以获得目标肽和各主要副产物的结构信息，包括化学修饰反应发生的具体位置等，从而有利于快速、准确确定合成 目标肽的真实性和研究副反应的发生机制。成为分析鉴定化学合成多肽及其副产物、研究副产物形成机制和优化合成方案的有效工具。