电喷雾串联质谱图的叠合与多肽序列分析王贤纯 梁宋平(湖南 师范大学生命科学学院　长沙 410081) 摘要　 利用离子阱电喷雾串联质谱仪 ，在选择性改变某些仪器参数的条件下对模式分子 Met-脑啡肽和自行固相化学合成的7肽及其修饰产物 、l0肽和20肽进行碎裂处理，从而获得一系列具有一定差异的串联质谱图，选择有适当互补性的图谱进行叠台处理，得到具有连贯性“三联套”（triplet）及“二联套”(double)碎片离子峰的叠合串联质谱图。据此可以方便准确地解析出多肽的氨基酸序列。实验结果表明，这种方法往多肽的质谱法测序中具有一定的实用性。　 关键词　 串联质谱；序列测定 ；图谱叠合；多肽　 研究未知蛋白质的结构与功能时，首先要做的工作之一是测定其氨基酸序列，随着蛋白质组学研究的进展和不断深入，以 Edman降解为基础的传统测序方法已难以适应蛋白质结构研究的微量测序要求利用“软”电离技术的串联质谱具有测序功能，能在微量乃至超微量水平准确快速地进行蛋白质多肽的氢基酸序列分析，从而在蛋白质组学研究中成为鉴定蛋白质的关键技术之一[1-3]。通过串联质谱图的解析推断蛋白质多肽氨基酸序列的基本方法之一，是在串联质谱图中找到连续的“三联套”(triplet)及“二联套”(doublet)系列碎片离子峰 ：An、Bn　和 Cn　，Xn、Yn 和 Zn，同系列中相邻成套碎片离子峰间的质量数之差即代表一个氨基酸残基[4、5]。然而，多肽的碎裂化学是复杂的，常常在形成系列碎片离子峰时出现“缺口”，从而给串联质谱图的解析带来困难。　 进行串联质谱实验时发现，适当调节某些仪器参数 (如激发电压)的大小 ，可以得到具有一定差异的串联质谱图。这些图谱在碎片离子峰的多少和信号强弱的分布区域等方面具有一定的互补性，提示可以打选择地将它们叠合起来进行分析，从而达到易化串联质谱图的解析和提高多肽氨基酸序列推测准确性的目的。本研究首先利用Met-脑啡肽作模式分子，探讨串联质谱图的叠合与解析的一般方法，然后用同样的方法对固相化学合成多肽进行序列鉴定 ，以检验该方法的实用性。 1 材料 和方法 (Materials　and　Methods)　 1　l 材料　 三氟乙酸 (TFA)购自 Eastman公司：Met-脑啡肽购自Sigma公 司；乙腈 (ACN)和冰醋酸分别为国产色谱纯和分析纯试剂；7肽、10肽和 20肽均为本实验室用固相法化学合成。　 1　2 方法　 1．2．1 样品液制备　 将多肽样品溶于乙腈：水冰醋酸(50：50：0.2)溶液中，浓度约为 l0-5 mol／L。　 1．2　2 质谱分析　 多肽样品的质谱分析在美国Bruker公司生产的 Esquire-LC离子阱电喷雾质谱仪上进行。正离子方式检测 ，离子电荷控制(ICC)，碰撞气为氦气。采用注射泵直接进样 ，流速为 200μ1／h。喷雾器压力 15psi，干燥气(N2 )流速 5.0L／min，干燥气 (N2 )温度 300℃ ，离子阱驱动 55.0。平均数 5，滚动数 5，扫描范围 50-2200m／z，在上述各主要参数固定的前提下，改变激发电压等参数，获得一系列串联质谱(MS／MS)图，以轮廓谱的形式储存。 1．2．3　MS/MS图的叠合与解析　 选择谱峰互补性较好的 MS／MS图，利用 Bruker　Dataamalysis软件处理得到适宜的 Ms／Ms叠合图；利用软件中的 Find　Masslist功能列出所有谱峰的 m／z值 ；截去下部的背景峰，先在上部的碎片离子峰中按 Bn+Ym-n=(M+H)+1(m为多肽残基总数)的规律寻找成对的 Bn和 Yn峰，然后按 An、Bn、Cn和 Xn、Yn、Zn的形成规律搜寻“三联套”及“二联套”碎片离子峰(先用第一种方法寻找可筛掉相当一部分谱峰，减少搜寻“三联套”及“二联套”碎片离子峰的工作量 )，并适当结合其他一些特殊碎片离子峰提供的结构信息进行综合分析；最后利用软件的Annotation和Comment等功能解析和标记叠合的串联质潜图，推断和验证出多肽的氨基酸序列 。　 2 纳 果(Results)　 2．1　 Met-脑啡肽的 MS／MS分析　 不断加大激发电压，对 Met脑啡肽 (H2N-YC-GFM-COOH，Mr 573.67)进行碎裂处理、获得一系列 MS／MS质谱图。根据图谱峰的互补情况，利用Bruker　DataAnalysis软件将 Met-脑啡肽的 1、3、6号MS／MS图叠合各图谱中主要碎片离子峰分布情况见表1。　 从表1可以看出，尽管 Met-脑啡肽的各单一MS／MS图所含有的碎片离子峰不完全“成套”，但叠合后组成了若干个连续的“三联套”及“二联套”碎片离子峰。叠合处理带来的不仅是峰的“有 ”、“无”互补 ，还有“强”、“弱”互补 、从而可以快捷准确地分析Met-脑啡肽的氨基酸序列(图 1)。　 2　2 合成 7肽及其修饰产物的质谱鉴定　 固相化学合成 7肽的序列为H2N-YVNTNMG-COOH（Mr797.90)。合成粗品经RP-HPLC纯化后 ，土峰物质的 MS分析结果见图 2。　 图2显示，主峰物质的 m／z值(M+H)+　为798.89与目的肽理论分子量很接近 ，提示该合成产物可能即为所要合成的 7肽 ，但需对其氨基酸序列进行鉴定 。在得到的一 系列 MS／MS图谱中 ，利用 Bruker　DataAnalysis软件将互补性较强的 2号 、16号和 18号 MS／MS图谱叠合，然后按照实验方法中叙述的方法进行解析。结果表明，可在其MS／MS叠合图中分辨出除 AIBIC1外的几乎所有AnBnCn碎片离子峰和除 X1Y1Zl，X2Y2Z2外的所有 XnYnZn碎片离子峰(表2)，从而为推断多肽序列所需系列碎片离子峰的确认提供了保证 。m／z值为 798.89的合成产物即为所要合成的目的肽，其氨基酸序列与要求的完全相同．见图 3。　 在利用 RP-HPLC分析合成7肽粗品时，还收集了一个“杂峰”。MS分析 (MS图未列出)结果表明，该杂峰物质的 m/z值 (M +H)+为 814.57，提示它是目的7肽的一个修饰产物。为了探明修饰的实质，我们用类似的方法得到了该修饰 7肽的叠合MS/M S质谱图，并利用碎片离子峰的“三联套”规律帮助确定 Bn和 Yn峰的存在 。结果 (图 4)表明 ，该修饰7肽是由目的7肽的第6位 Met氧化后形成的。　 2.3 合成 10肽的质谱鉴定　 10肽的序列为H2N-FLPSDFFPSV-CONH2(Mr1154.34)。按照上述方法得到的叠合 Ms／Ms质谱图(图5)中，除低 m／z区外，其余部分都形成了连续性的成套碎片离子峰 。图中只标出了根据连续性成套碎片离子峰确定的 Bn和 Yn系列谱峰。解析结果表明 ，合成产物的氨基酸序列与要 求的相符。　 2.4 合成 20肽的质谱鉴定　 为了进一步鉴定串联质谱叠合法在鉴定多肽氨基酸序列中的实用性 ，我们又用固相合成的20肽进行了同样的质谱分析实验，该 20肽的序列是：H2N-LLTRILTIPQSLDSWWTSLN-CONH2， (Mr2356．79)。MS分析结果证明，20肽的分子量与理论值相符(MS图未列出)，其 Ms／Ms叠合图如图6。用同样的方法确定了序列解析中起重要作用的连续性 B1～B18和 Y4-Y18系列碎 片离子峰。该多肽中含有较多的 Leu和 Ile，二者的区分是质谱法测序的难点之一 ，对此将另文探讨。 3 讨论（Disc ussion） 由于MS/MS峰型不仅受激发电压大小的影响，而且与毛细管出口电压和铲削器1及铲削器2等的电压设置有关，所以为不同MS/MS图谱的制备和选择提供了有利条件。以脑啡肽为模式分子的实验结果表明，当利用单一的MS/MS图谱难以有效地推断出多肽的序列时，采用图谱叠合的方式将有助于问题的解决。 在多数情况下，MS/MS图谱中的谱峰大多相对集中于图谱的中部，高、低m/z区的谱峰较少，这与“扫描范围”和“离子阱驱动”等参数的设置有关，所以制备系列MS/MS图谱时要注意调节仪器参数，分别获得一些谱峰相对集中于高m/z区或低m/z区的谱图，以利叠合时的互补。不过，有时图谱两端缺乏部分谱峰并不影响图谱的解析和多肽末端结构的推断，因为可以利用最大的Bn和Yn碎片离子峰与多肽分子量的差值鉴定多肽的C末端和N末端。由于An、Bn、Cn系列和Xn、Yn、Zn系列所提供的结构信息有着反向互补的关系，所以，推断多肽序列时，其中任何一个系列的少量“缺口”造成的结构信息的缺乏可能用另一系列来“填补”。同时，选择用于叠合的MS/MS图时、不仅要注意谱峰有无互补，而且要注意谱峰的强弱互补。此外，还要注意仪器的稳定性，否则各MS/MS图谱的相同峰之间缺乏重叠性，无法叠合应用。 本实验结果及同时进行的相关实验资料表明，图谱叠合法增加了MS/MS谱图的信息量，有利于根据碎片离子峰的“三联套”规律确定主要系列离子峰的归属，从而提高了解析串联质谱图和推断小分子多肽氨基酸序列的准确性。对在了解多肽基本序列信息的前提下。验证化学合成多肽的序列和判断化学修饰位点之类的工作尤为有效；即使是解析未知多肽的氨基酸序列，图谱叠合法也将有助于同题的解决。当然，图谱叠合也增加了图谱的复杂程度(谱峰增多)，但是在一定的范围内并不影响图谱的解析，因为“三联套”的确定是基于特定碎片离子峰的m/z值的差异(如An = Bn-28或27， Cn=Bn+17)，一般而言，谱峰之间的距离不小于1.0 u就不会严重干扰确定特定谱峰的归属。对于分子量较大的蛋白质和多肽，采用图谱叠合法有时会使叠合图谱过于复杂、反而给最后的解析带来困难，这就需要事先将蛋白质和多肽分子降解成较小的片段。蛋白质组学及其他相关研究中，采用酶解的方法将分子量较大的蛋白质和多肽裂解成较小的片段，然后用色谱-质谱联用的方式，在分离这些片段的同时用串联质谱法测定片段的氨基酸序列，已经取得了较好的效果[6-11]。如果在不同的质谱条件下对某一酶解样品重复分析多次，然后用类似叠合分析的方法，将同一片段的多个MS/MS图综合分析，将有可能明显提高序列测定的准确性。