1 肽营养研究概况 1.1 肽在动物体内的吸收机制及其特点1.1.1 单胃动物体内的吸收机制 日粮中的蛋白质经动物消化道内一系列酶的作用,最终降解为游离氨基酸和小肽,关于小肽的转运机理，可能有以下3种形式：①具有pH依赖性的氢离子和钠离子转运体系，不消耗ATP；②依赖氢离子或钙离子浓度的主动转运过程，需要消耗ATP；③谷胱甘肽（GSH）转运系统。 1.1.2 反刍动物体内的吸收机制 Webb（1993）提出反刍动物氨基酸和肽的吸收存在肠系膜系统和非肠系膜系统两种途径。空肠、结肠、回肠、盲肠吸收的小肽进入肠系膜系统，而由瘤胃、瓣胃、网胃、皱胃、十二指肠吸收的小肽则进入非肠系膜系统。1.1.3 肽的吸收特点 肽的吸收具有速度快、耗能低、不易饱和，且各种肽之间转运无竞争性和抑制性的特点。1.2 肽的营养功能及影响肽释放、吸收和利用的因素 据研究报道，小肽具有促进氨基酸的吸收，提高蛋白质的沉积率；促进矿物质元素的吸收利用；提高动物生产性能； 促进瘤胃微生物对营养物质的利用等营养功能。肽还能阻碍脂肪的吸收，并能促进“脂质代谢”，因此， 在保证摄入足够量肽的基础上，可将饲料其它能量组分减至最低。另外，体内小肽可促进葡萄糖的转运且不增加肠组织的氧消耗。Cuber(1989,1990)还发现，酪蛋白水解的某些肽能促进大鼠CCK的分泌。Azuma(1989)则发现鸡蛋蛋白中提取的某些肽能促进细胞的生长和DNA的合成。 许多小肽具有生物活性作用可分为免疫活性小肽、神经活性小肽、抗氧化活性小肽等，它们能够调节生物机体的生命活动或生理作用，激素作用、免疫调节作用、抗菌作用以及消化、吸收促进功能。 影响肽释放、吸收和利用的因素很多，其中包括：蛋白质的品质；蛋白质的加工、贮藏条件；肽链长度；蛋白质的氨基酸组成等。另外，小肽与游离氨基酸的比例不同对动物氨基酸的吸收也有影响。 1.3 几种肽制品 1.3.1 肠膜蛋白粉（DPS） 其主要成分是猪肠粘膜的水解蛋白，除含丰富的氨基酸外，还含有大量的寡肽。早期断奶仔猪饲喂DPS可明显提高仔猪的脂肪酶和胰淀粉酶的活力，而且可使小肠绒毛膜增加，隐窝变浅，从而提高仔猪对营养物质的消化吸收，同时减轻腹泻和促进生长。1.3.2 喂大快 是海鱼蛋白水解产物，含有一定量的生物小肽、有机螯合微量元素等。喂大快适用范围广，有提高动物成活率、产蛋率和受精率等功效。1.3.3 百傲康它的主要活性成分是L-丙氨酰-L谷氨酰胺二肽，是一种优秀的小肠营养补充物。2 肽的工业生产研究概况2.1 化学合成法 有固相与液相两种方式，操作虽然不同，但是其原理几乎是一样的。化学合成法虽然发展较早，也比较成熟，但仍有许多缺点，包括①消旋化现象；②侧链官能团需要保护；③整体效率低；④使用大量的有毒溶剂，且成本高昂。因此化学合成法多半用在实验室，或是高价肽的生产上。2.2 DNA重组法 没有化学合成法的缺点，且一旦整合成系统建立好，将可以大量的重复性生产所要的活性肽。但目前的技术在基因的表达与产品回收上仍有问题，同时该法生产的活性肽种类也有限制，不能生产酰胺肽，也不适合制备短链肽。2.3 酶法 此法则有许多的优点，包括反应较温和、使用的试剂毒性较低、反应具有空间立体性，产物没有消旋化现象、反应位点具有方向性等。然而，酶发也有局限，利用蛋白酶催化活性肽的合成，最明显的副作用是蛋白酶本身的水解作用，会造成许多不必要的产物生成，此外缺乏适合使用的蛋白酶、产率低等技术问题也限制酶法的广泛应用。 2.4 微生物发酵法 此法是通过微生物的生化反应将大豆蛋白转化为大豆肽。此法生产的肽不是将大豆蛋白质简单切成小肽，而是通过微生物作用可以对某些苦味基因进行修饰和转移、重组、在发酵过程中，小肽氨基酸之间又经过代谢、同化，将大豆肽转化为生物活性肽。 3 大豆肽蛋白酶法生产可行性探索试验 大豆是一种优质高蛋白高脂肪作物，含蛋白质35.5%左右，含粗脂肪18%~20%。豆粕中几乎含大豆中的所有蛋白，除蛋氨酸含量较低外，其余氨基酸都十分充足，尤其是赖氨酸和谷氨酸，蛋白质量高，价格低，是饲料上常用的优质蛋白质饲料原料。大豆肽是大豆蛋白经蛋白酶水解或微生物发酵等方法所制得的分子量集中在1 000以下并具有某些生物学功能的混合寡肽。它既有大豆蛋白质的营养学特性，又具有小分子肽所特有的物化特性。本试验希望为利用豆粕制作大豆肽添加于饲料提供了合适的酶浓度这一试验参数，对豆粕的2709碱性蛋白酶水解进行了较系统的研究。3.1 试验设计 本试验配制酶浓度分别为0U/ml、200U/ml、400U/ml、600U/ml、800U/ml、1 000U/ml，其它试验条件不变，通过测定水解度、氮溶指数、蛋白得率、酸溶性氮得率、游离氨基酸这5个主要试验指标，根据试验结果并结合工业生产实际确定最合适的酶浓度。试验方法中每个试样均取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。3.2 材料与方法3.2.1 试验材料 豆粕（含脂1.2%），由无锡正大畜禽有限公司提供。挑选无霉变的优质豆粕，用粉碎机粉碎，过60目，阴凉干燥保存备用。 2709地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶（浙江海宁金潮实业有限公司产品）。此酶的活性单位为100万单位/g纯酶粉，最适作用pH9～12，最适温度为45～55℃。 3.2.2 试验指标及其测定方法3.2.2.1 用凯氏定氮法测定蛋白质含量（N×6.25）。3.2.2.2 蛋白质水解度（Degree of hydrolysis，简写DH）DH（%）=打断的肽键数目/总的肽键数目×100% 碱性蛋白酶作用条件下，DH可由下式来计算： DH%=V?N?1/a?1/Mp?1/h01 式中：V--消耗碱体积（ml）； N--摩尔体积（mol/l）； Mp--水解反应中蛋白质总质量（g）； h01--为每1g蛋白质中肽键的克当量（取8.38）； a--a氨基酸的解离度，a＝［10（pH-pK）］/［1＋10（pH-pK）］，其中pK为氨基的平均pK，按7.0算（平均解离常数）， pH为反应起始pH值。 用此方法测定DH，可以依照消耗的碱量做到随时测出DH。大豆蛋白被2709碱性蛋白酶水解时，使pH不断降低，以自动电位滴定仪保持pH=9.9，每隔一定时间读出用去的NaOH量则可计算水解度。3.2.2.3 氮溶指数（Nsi） 指溶液中的氮量与样品中总氮量之比，即 氮溶指数（%）=提取滤液中含氮量(g)/加入豆粕总氮量(g)×100% 氮溶指数是衡量豆粕蛋白变性程度的唯一指标。将水解液过滤、离心、定容，取定容滤液,用凯氏定氮法测定其中氮的含量，即为可溶性氮，与被加入的豆粕总氮之比为氮溶指数。 3.2.2.4 蛋白得率 pH=4.5时，大豆蛋白等电点沉淀，测定沉淀的粗蛋白量与加入的豆粕的总粗蛋白量之比即为： 蛋白得率（%）=沉淀蛋白量/豆粕总蛋白量×100% 它是一个检验酶对蛋白的水解能力的评估指标。将滤液pH调节至4.5（大豆蛋白的等电点），使大豆蛋白等电沉淀，测定沉淀的蛋白量，与被加入豆粕的总蛋白之比为蛋白得率。 3.2.2.5 酸溶性氮得率 等点沉淀后滤液中可溶性氮则视为酸溶性氮，与所加豆粕的总含氮量之比即为：酸溶性氮得率（%）=等电沉淀后滤液中的氮/所加豆粕的总含氮量×100% 它也是一个检验酶对蛋白的水解能力的评估指标。3.2.2.6 水解液中游离氨基酸的量用甲醛法滴定氨基酸氮，测定氨基酸的量，可以说明酶水解蛋白产生氨基酸的效果。 3.3 结果与分析 豆粕蛋白含量为44.1%。3.3.1 蛋白酶浓度对豆粕蛋白水解度的影响 3.3.1.1 不同酶浓度在同一水解条件下连续水解10h，各时间段水解度如图1所示： 结果表明：在48℃下连续水解10h，最大水解度可达41.81%。水解度在前2h内迅速增加，随着水解的继续进行，水解度增加趋势渐缓，5h以后几乎不再增加。这表明随着水解时间的延长，酶的活力渐渐降低，最终丧失。水解5h即可达到很好的效果，再延长水解时间将增加生产成本，降低经济效益，是不可取的。3.3.1.2 不同酶浓度在同一水解条件下连续水解5h，各时间段水解度如图2所示： 结果表明：在48℃下连续水解5h，酶浓度为400U/ml时水解度即达到30%。 3.3.2 不同酶浓度对豆粕氮溶指数Nsi的影响 选用不同浓度2709碱性蛋白酶进行水解，测得其Nsi 与酶浓度的变化关系见图3： 结果表明：当酶浓度为0，在中性条件下，豆粕的氮溶指数为35%，为中高度变性豆粕。而在碱性条件（pH=9.9）下，氮溶指数增大到59.18%。另外随着酶浓度的增加，Nsi也随之增大，但在酶浓度200U/ml以上，酶浓度再增加Nsi增加趋势渐缓。2709碱性蛋白酶可以提高豆粕的氮溶指数，这说明酶对蛋白有良好的水解能力。3.3.3 不同酶浓度对蛋白得率的影响 不同酶浓度与蛋白得率的关系如图4所示： 结果表明： 2709碱性蛋白酶使蛋白得率有了很明显的降低，这说明该蛋白酶对豆粕蛋白具有良好的水解性能。但在酶浓度200U/ml以上，酶浓度再增加蛋白得率下降趋势渐缓。3.3.4 不同酶浓度对酸溶性氮得率的影响 不同酶浓度与酸溶性氮得率的关系如图5所示： 结果表明：随着酶浓度的增加，酸溶性氮得率也随之增大，但在酶浓度200U/ml以上，酶浓度再增加酸溶性氮得率上升趋势渐缓。另外，在酶的作用下酸溶性氮得率都在70%～80%左右，说明水解效果非常好。 3.3.5 不同酶浓度对游离氨基酸含量的影响 结果表明：随着酶浓度的增加，水解液中氨基酸含量也随之增大，但都在9%~10%之间。2709碱性蛋白酶是一种专一性差的内切酶，控制好试验条件可以既经济又高效的得到肽溶液，且产生较少的氨基酸。3.4 讨论 3.4.1 生产成本概算 本试验是探索酶法工业生产大豆功能性短肽的可行性，本着商业化生产低成本、高效率的原则，试验的每一步设计都考虑与实际生产结合。试验所涉及的方法，大部分能被工业生产所接受。根据试验结果，考虑实际生产情况，结合工业生产的经济效益，选定酶浓度为400U/ml，水解1kg 豆粕可得到350g水解产物（包括肽和氨基酸），其中氨基酸略小于35g。具体成本费用如表1所示：3.4.2 水解肽的质量考查大豆肽的质量指标 酶浓度为400U/ml时试验结果与标准比较见表2，表明水解得到的大豆肽质量良好。3.4.3 试验的不足之处及其后续工作 由于时间与条件的限制，最终未能将试验完成，只进行到了水解阶段，测得了以上数据并得出了以上结论，仅供参考。还有许多地方需要改进和完善，并且还有一些后续工作有待完成。 整个试验中酶的使用是生产成本的一个重要部分之一。如果酶能够连续持久的使用，可以很好的降低生产成本。建议使用现代生物技术将酶固定，以提高其利用率。由于条件和时间的限制，本试验未对此进行研究。 本试验仅通过对游离氨基酸的测定，及通过对酸溶性肽得率的计算从侧面反映了水解产物--肽的质与量的情况。但是这并不能反映出水解产物中究竟含有哪些物质，是否有用都不清楚。我们采用酶法降解大豆蛋白主要是为了从水解物中能够提取某些生物活性肽，作为饲料添加剂。然而，由于水解产物比较复杂，提取比较麻烦，增加了经济成本，应该进一步改进提取工艺。 3.5 结论 本试验通过对豆粕的2709碱性蛋白酶不同酶浓度水解情况进行了较系统的研究比较，结合实际生产，考虑经济效益，最终选定酶浓度为400U/ml。酶浓度为400U/ml时，水解度为29.78%，氮溶指数为79.25%，蛋白得率为5.97%，酸溶性氮得率为73.28%，游离氨基酸占总氮的百分比为9.61%，水解1kg豆粕生产成本为23.9元。4 结语与展望 小肽的营养已逐渐被人们接受和认可，在加强小肽营养的理论研究的同时，肽制品的开发和研制也已经引起了人们极大的关注。然而，肽的生产还存在很多亟待解决的问题：如果生产条件控制不当，是否会产生对动物机体有害的肽类？如何鉴别与剔除有害的肽类？如果利用酶法生产，由于不同的酶有不同的切点，是否可以用不同的酶之间的合理搭配，使蛋白最大限度的水解成短肽？如何用经济的方法从蛋白水解物中提取活性短肽？因此，对肽的生产及应用还需进行更加深入细致的研究，使肽营养理论更好的服务与畜牧业及人类健康。