QDs标记免疫调节肽及其与T细胞作用的表征王丽凤1， 王丽萍1， 陈 洁1， 房学迅2， 李 惟1(1. 吉林大学生命科学学院； 2. 吉林大学药学院， 长春 130023) 关键词 半导体量子点(QD s)；荧光标记； 免疫调节肽 量子点是直径为 1 ～10 nm 的球形半导体纳米晶体， 也被称为半导体量子点， 简称 Q Ds，与有机荧光染料相比， QDs 具有激发光谱单一、荧光谱线窄、发光效率高、发光颜色可调、可进行多色联合标记， 并且光稳定性好等优点， 所以量子点是非常有前途的生物标记物[1 ，2]，研究结果表明， 量子点可以与许多生物分子如蛋白质、多肽、核酸及小分子配体等偶联，现已有许多关于量子点标记生物分子的报道， 如用量子点标记木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、天花粉蛋白和表皮生长因子等[ 3 ～5 ]，用量子点标记生物分子作为荧光探针已成功地应用于多种生物分析， 如 D NA 杂交监测、免疫分析和用 QD s 检测 A TP推动的反应等[4 ，6，7 ]，目前， 对量子点标记生物分子的报道多为对大分子蛋白质的标记， 而对小分子肽标记的报道却很少。 TP5 为胸腺肽类激素， 临床研究结果表明， 其具有免疫调节活性 [8]， 其与 T 细胞表面受体结合，具有诱导 T 细胞分化， 促进 T 淋巴细胞亚群增殖并活化的功效[ 9]。 本文探讨了QDs与短肽片段进行直接偶联的条件， 并对胸腺五肽(TP5)进行了标记， 通过对 Q Ds标记的 TP5 与 T 细胞作用， 表征了 QD s 标记的 TP5 在 T 细胞表面的分布， 为监测免疫活性肽复杂的体内过程提供了一个直观、可视的方法。 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 N -羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1，3-二环己基碳二亚胺(D CC)及 N -甲基吗啉(N M M )均为国产分析纯试剂。 高效液相色谱 ( W aters 515 + 2487 + 2475， 美 国)， 色 谱 柱为 ZOR BA X300SB -C18( A gilent， PN880995-9025 μm ， 4.6 m m ×250 m m ， 美国)， 显微镜(Olym pus BX51， 日本)。 1.2 实验过程 (1) QDs 与免疫活性肽TP5 的偶联及偶联产物的纯化，用巯基丙酸包被的 CdTe QDs经 C18固相萃取柱纯化， 将经纯化的 QD s 乙腈溶液3m分别加入到150 μL(5.0 ×10-3mol/L)NHS和DCC的乙腈溶液中， 于室温反应20 min， 加入300 μL 肽的水溶液(浓度为 5.0 ×10- 3mol/L)， 用 N M M调节 pH 值至 8 ～9， 于室温反应 96 h， 用 H PLC进行荧光检测，荧光激发波长为 400 nm ， 发射波长为570 nm ，收集产物峰， 得到量子点标记肽。 (2) T 细胞的提取及 Q D s-TP5 与 T 细胞表面受体结合， 将昆明小鼠断颈处死， 取脾， 提取 T 细胞，用 IM D M 培养液制成细胞悬液， 细胞浓度为 5 ×106 个 /m L. 将细胞悬液接种于 96 孔板上， 分别加入Q D s和 Q D s-TP5， 于 37 ℃的 5% CO2培养箱内培养 4 h， 然后用荧光显微镜观察并照像。 2 结果与讨论 2.1 QD s 标记 TP5 对小肽与 Q D s直接偶联反应的条件进行了考察， 实验结果见图 1。 图 (A )为纯 QDs 的H PLC 谱图， 图 1(B )分别为 TP5 与 Q Ds 反应 24， 48， 72 和 96 h 的 H PLC 谱图， 可以看到， 纯 Q D s的荧光强度微弱， 保留时间为 10.7 m in，随着反应的进行， 产物峰出现， 产物的保留时间比Q D s延后 4 ～8 m in， 且随着反应时间的延长， 产物的荧光强度不断增强， 96 h 后恒定， 达到最大值，Q Ds-TP5 的荧光强度是纯 QD s 荧光强度的 9.0 倍。 结果表明， 本实验所采用偶联方法成功地将小肽直接偶联到了Q D s上， 这一结果为合成保持原有配体结合活性的肽-Q D s标记物提供了有效的方法， 该结果也显示， 反应产物的谱图为多峰， 说明 Q Ds与小肽的偶联产物有多种，Q Ds 表面被巯基丙酸包被， 使得 Q D s 表面包裹一层游离羧基， 因此， 在偶联试剂的存在下， 它能与小肽中的游离氨基形成酰胺键. 由于 Q D s 表面有多个游离羧基， 而小肽中游离氨基的数目也不止一个， 所以可以随机产生多种不同的 QD s 标记肽的产物。 2.2 QDs 标记 TP5 与 T 细胞的相互作用 为使 TP5 与 T 细胞相互作用可视化， 用QDs标记免疫活性肽， 通过荧光检测来研究 QD s-TP5 在 T 细胞表面的分布是很有意义的。 以QDs 与 T 细胞的作用为阳性对照， 对 Q D s和 Q D s-TP5 在细胞中的分布进行了观察， 结果显示，Q D s与 T 细胞作用时， 由于单纯 QD s 与 T 细胞膜不存在相互作用， Q D s 直接进入细胞内部， 使细胞核呈现黄色荧光[图 2(A )]. Q D s-TP5 与 T 细胞作用时， 它们与细胞膜表面受体结合， 在显微镜下看到细胞膜表面呈现黄色荧光[图 2(B )]， 这一结果直观地表征了免疫活性肽与 T 细胞表面受体的结合。