摘要：抗菌肽(antibacterial peptide，ABP)主要是由多种因素诱导昆虫而产生的抗菌多肽类物质。其中主要包括天蚕素(Cecropin)、防御素(Defensin)和防护素(magainin)等。自从1962年stephens等发现免疫大腊螟幼虫血淋巴中具有一种杀绿脓杆菌的免疫因子起，昆虫体内的这种抗菌物质引起了人们的极大重视，到Boman等(1981)首次从美国天蚕(Hyalophora cecropin)中成功地分离到两种抗菌肽——蚕素(cecropin) A和B后，国内外很多科学家对这一类抗菌肽进行了深入细致的研究，发现在许多昆虫、植物、哺乳动物中均有这样的多肽存在，它们由30多个氨基酸残基组成，不同来源的多肽的氨基酸序列具有较强的保守性，现已发现750多种，并从中分离纯化出的许多种抗菌肽，它们参与了抵抗微生物侵害的最初宿主防御活动，是内源免疫体系成分。昆虫抗菌肽是昆虫血淋巴中产生的一类小分子肽，当昆虫受到外界微生物的刺激时，可大量迅速地合成。它具有热稳定性强，强碱性，抗菌谱广的特点，可以抗革兰氏阳性菌，也可以抗革兰氏阴性茵，有些甚至对病毒和肿瘤细胞均具有抗。昆虫防御素大量存在于昆虫血淋巴液中，至今已在昆虫纲中发现了30多种防御素，这些昆虫包括双翅目、膜翅目、毛翅目、半翅目、蜻蜓目。昆虫防御素对革兰氏阳性和阴性菌都有杀伤作用，相对而言，它们对革兰氏阳性菌更显强杀伤能力，这一点与哺乳动物的防御素是一样的，但是植物的对这两类菌都无明显杀伤作用。昆虫抗菌肽具有只作用于原核细胞而对真核细胞无害等特点，在当前抗生素的耐药性较为普遍，开发一种新的抗生素又极其困难的情况下，倍受人们青睐。关键词：昆虫 抗菌肽 作用机理1.昆虫抗菌肽的种类不同诱导源所诱导的抗菌物质的种类和数量早有一定差异的，如柞蚕蛹用大肠杆菌作诱导时，以PqD为主，用二氮杂菲诱导时以PqE和PqA为主，所以不同昆虫采用同一诱导源，将产生不同的抗菌肽，抗菌活性高峰时间亦可不一致；同一昆虫，采用不同诱导源所产生的抗菌肽不同，高峰诱导期亦不相同。昆虫抗菌物质研究的有关种类、诱导产物及其特性详见表l，鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目的主要抗菌蛋白（肽）见表2。昆虫抗菌肽已发现100多种，根据抗菌肽所富含氨基酸种类、结构和功能可分为4大类：Cecropins（天蚕素）类昆虫抗抗菌肽、有分子内二硫桥的昆虫抗菌肽类（Insect Defensins昆虫防御素）、富脯氨酸的昆虫抗菌肽类、富含甘氨酸的昆虫抗菌肽类。2.杀菌作用抗菌肽具有如下共同特点：1)N端由碱性氨基酸残基组成；2)C端均酰胺化；3)绝大多数多肽在第2位均为Trp，它对杀菌活性至关重要；4)它们都有较广的杀菌谱。抗菌肽对细菌、病毒、念珠菌、原虫、癌细胞具有广谱的活性，能抑制革兰氏阳性和阴性球菌和杆菌，如绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒扦菌、痢疾杆菌、布氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等等，并对感染植物的多种病原菌也有明显的杀菌作用。另外，抗菌肽对高度耐药的伤寒杆菌、耐药性金葡菌同样敏感，对感冒、疤疹病毒能抑制其繁殖，对疟原虫、痢疾阿米巴均有效。目前的研究结果表明，抗菌肽抗菌的关键是在质膜上形成离子通道性质的孔洞，致使细胞内外渗透压改变，细胞内容物尤其是K+大量渗出，细菌因此而死亡。SteinerII等(1981)用圆二色谱法研究了抗菌肽的高级结构，发现抗菌肽在磷酸钠缓冲液中呈自由卷曲的构象，而加入六氟丙醇降低溶液的极性以模拟细胞膜的疏水环境时，抗菌肽的α-螺旋数量明显增加。研究表明Attacins能够干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白OmpC、OmpF、OmpA以及LamB基习的转录使这些蛋白的含量减少，从而导致细胞膜的通透性增加，细菌的生长受到抑制(Carsson and Bennich，1991)。这说明抗菌肽在水活性环境里没有稳定的构象．只是在结合或接近细胞膜时才形成发挥功能的高级结构，这可能是抗菌肽对热稳定的原因。抗菌肽插入细菌质膜的过程可能如下：第l步，在水相至质膜交界面上，抗菌肽寡聚物与脂质双层膜之间通过静电吸引而靠近，带正电荷的肽端集聚于此；第2步，C端流水区插入膜中，两亲性的。螺旋置留于膜界面的位置；第3步，两亲性的螺旋插入质膜，由于其亲水、疏水两性存在，在质膜上形成较大孔洞，细胞因而不能保持正常渗透压而致死。而Sarcotoxin 能够抑制细菌细胞壁的形成，便细菌不能维持正常的形态而生长受阻，但对已经形成的细胞壁不起作用。蜂毒抗菌肽在水溶液中结构不固定，但它与胞膜结合后就会采取一种两性分子的构象，这使得它以一种表面结合的方式插入细胞膜双分子层的外层，当细胞膜能量足够时，肽就会仍然以这种表面结合的方式穿过细胞膜，并带上磷脂，几个肽分子结合在同一位点就会形成一个暂时性孔道。Nakajima等(1987)用Sarcotoxin IA(一种抗菌肽)与模拟膜的脂质体作用时，发现当脂质体含有胆固醇时抗菌肽的作用效应明显降低。胆固醇是真核细胞膜的固有成分，原核细胞膜中不含胆固醇，这可能是昆虫抗菌肽只作用于原核生物的重要原因。Hoffmann(1992)试图从分子水平解释这种选择作用，他认为昆虫抗菌肽的这种识别机制是由于在昆虫抗菌肽的表面存在一类非克隆化的受体，这种受体能够检测到致病微生物保守的分子结构。如：脂多糖(LpS)为革兰氏阴性细菌共有的分子结构、革兰氏阳性细菌的磷壁酸、霉菌的甘露多糖(Mannans)、聚糖(glycans)和RNA病毒的双链RNA等。对它的作用的机理已做了许多研究。早先Okada等发现用麻绳索I(SarcotoxinI)处理后，Ecoli对脯氨酸和四苯基磷酸盐的吸收停止了，而这些物质的膜间运输斋要膜间的电化学势，进一步的研究发现Sarcotoxin I扮演着离于泵的角色，它使得细胞内的钾离子快速地被析出，三磷酸腺甘含量疾速下降。这些现象提示抗菌肽的抗菌作用可能是其在细菌的细胞膜上形成了孔道造成细胞内物质泄漏导致电化学势的丧失。为证实这一点，抗菌肽与脂质体相互作用的研究被做了许多。Nakajima等用酸性磷酯制备的脂质体与sarcotoxin IA作用，观察到包在指质体里的葡萄糖分子被释放了出来。屈贤铭等用榨蚕抗菌肽B、D与不同磷酯组成的脂质体作用，发现磷酯酰头的酸性愈强，抗菌肽对它的作用效应也强。而当脂质体中含有胆固醇时，其作用效应明显降低。胆固酵是真核细胞膜的固有成分，所以这可能是抗菌肽只作用于原核生物的重要原因。Steiner以不同长短的类似物与脂质体作用，发现抗菌肽裂解脂质体的能力与它和膜的亲合力相关。实验证明，抗菌肽与细胞表面之间静电作用是很重要的，Steiner等用放射性标记法证明天蚕素及其类似物能吸附于细菌上，这种吸盼作用是非特异的，对抗菌肽敏感或抗性的细菌都能吸附。脂质体试验表明，被试抗菌肽对脂质体的敏感度随着脂质体带负电荷的减少而降低。由这些可以推测可能是抗菌肽通过N一端“两性”螺旋带正电荷的一侧与细菌表面的负电荷发生静电作用而吸附。抗菌肽吸附于细胞表面可能是其裂解细菌的第一步。对抗菌此的作用机理，至今仍然存在不同看法，一种认为抗菌肽部分嵌入膜内造成膜的脂双层的有序结构的破坏，使膜崩溃，即抗菌肽起了表面活性剂或去垢剂的作用，这种模型要求抗菌肽有一段两亲a-螺旋以接近膜表面和一个疏水尾巴能插入膜内。一种认为抗菌肽结合到膜上只是反应的第一步，然后N端插入膜内，两个或多个分子聚在一起形成孔道，使膜内外环境相通，造成物质泄漏和电化学势丧失。抗菌肽的抗菌机制大致如下：抗菌肽对细胞超微结构的损伤是多方面的，对细胞膜、微绒毛、线粒体及细胞核均有作用，最重要的损伤部位是细胞膜的结构，胞膜、线粒体膜、核膜等都是由蛋白质和脂类所组成的一类膜性结构，破坏膜的完整性，造成离子通道．最终导致细胞内含物的泄漏。3.对癌细胞的作用目前研究结果表明，抗菌肽不仅对细菌有明显抑杀作用，而且对癌细胞和癌实体瘤也有显著效果，抗菌肽的抗癌作用及其体外实验研究，国内外早已有报道。抗菌肽对鼻咽癌、血癌、肺癌及某些转化细胞有选择性杀伤作用。Ganz(1989)报道，与防御素共同培养的肥大细胞，有脱颗粒现象，表明防御素在体内可能参与过敏反应。抗菌肽对K 562白血病细胞有明显的杀伤作用．而对正常人B淋巴细胞无不良影响。这为治疗白血病带来了希望。环磷酰胺(Cy)也可以有效抑制肿瘤的生长，但是对机体的伤害很大。注射环磷酷胺的小鼠白细胞只有1950个／mm；，远远低于正常标准，这是多数抗癌化疗药物的不足之处。临床结果显示，分析许多癌症思考死因，往往并不是死于癌症本身，而是由于大剂量化疗药物对身体极度伤害造成的。而抗菌肽的优越性就在于只对癌瘤有显著抑制作用，而对机体别无损伤。目前一致认为抗菌肽是接触性抑杀癌瘤细胞。贾红武等(1997)在研究家蚕抗菌肽对癌细胞U937的杀伤作用时，用扫描电镜和透射电镜观察并描述了抗菌肽作用于癌细胞以及超微结构的变化。经抗菌肽处理24h后的U937细胞，细胞表面的微绒毛消失膜表面布满了不规则的孔洞。36h后细胞膜上的孔洞增大，细胞膜局部溶解，结构不完整，细胞器等内容物溢出，整个细胞呈破碎状。许玉澄等在家蚕家蚕抗菌肽的抗癌作用研究中对比阴性组和给药组，发现给药组肿瘤周围有非常明显的炎细胞如淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的浸入，给药组正常机体与癌瘤接触区有大量结缔组织增生现象，形成区域化结构抑制癌细胞扩散的趋势，因此他们认为，抗菌肽不仅能接触性抑杀肿瘤，而且还能调动机体的免疫系统对抗癌瘤的侵入。抗菌肽对癌细胞超微结构的损伤是多方面的，首先使微绒毛收缩、脱落，接着细胞膜上形成许多微孔，微孔不断扩大使膜局部受损，细胞的通透性增加，问内溶物外泄，同时线垃体膨大，空泡化严重，内膜、嵴肿胀，排列紊乱或消失，细胞器等内溶物泄出胞外，细胞裂解死亡，这与抗菌肽的抗细菌细胞死亡的机制有一定的相似之处，这为治疗白血病带来了希望。4.控制基因由于获取天然抗菌肽面临许多困难，化学合成和手工固相合成比较昂贵，因此，人们对基因工程技术生产抗菌肽具有极大兴趣。迄今为止，天蚕抗菌肽A在昆虫系统中得到表达(Andersons and steiner，1991)，柞蚕抗菌肽D、绿蝇抗菌肽在酵母系统中、天蚕抗菌肽A在真核系统中表达研究也有报道，家蚕抗菌肽CM4突变体在大肠杆菌中的融合表达也获得成功。有的表达产物具有抗菌的活性，这些对抗菌肽的进一步工业化生产打下了基础。Apila抗菌肽是从蜜蜂体液中提取的一种短肽，由18个氨基酸组成，已经被成功克隆并在酵母中成功表达。通过定向诱变抗菌肽Cecropin B基因，并与GST基因融合表达后仍然具有很强杀伤原核细胞的作用，为采用CNBr切割融合蛋白的Met位点及大量制备抗菌肽打基础。蚕通过将抗菌肽的功能基因导入植物增强植物的抗病性，如抗菌肽基因导入根癌农杆菌培育抗青枯病的作物新品种，导入水稻原生质体选育抗白叶枯病的作物新品种。管志文等1994年将农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入桑树获得成功。陈善春等1997年首次成功将根癌农杆菌介导柞蚕抗菌肽D基因转化柑桔。