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微生物内氨基酸和小肽的分析方法及其应用进展
发布日期:2013-02-08  来源:全球肽网  浏览次数:5779
本文结合微生物样 品前处理方法,综述了目前氨基酸和小肚研究中所采用的各 种分析测定技术的特点及应用实例,系统分析了各种方法的 优缺点,同时展望了其发展趋势,以期为氨基酸和小肚分析 技术的研究提供思路

    继基因组学和蛋白质组学之后,代谢组学近年来发展迅
速,已成为系统生物学研究的重要组成部分,已成功应用于
微生物的基因突变或代偿机制引起的形态变化、耐药性等反
馈的识别和机制研究万’Zes。由于微生物代谢物质组(包含大
量氨基酸和小肚类物质)的复杂性,目前尚无一种分析技术
可以同时分析体系中所有的代谢物。故在微生物代谢组学
分析中,应根据不同类型代谢产物的特性采用不同的分析方
法,才能获得相对全面的代谢物指纹谱。本文结合微生物样
品前处理方法,综述了目前氨基酸和小肚研究中所采用的各
种分析测定技术的特点及应用实例,系统分析了各种方法的
优缺点,同时展望了其发展趋势,以期为氨基酸和小肚分析
技术的研究提供思路
前处理技术
    若需对微生物内氨基酸和小肚进行可靠的定性和定量
分析,首先要建立一套稳健的前处理方法,基本步骤包括淬
灭、提取、浓缩以及衍生化。需要注意的是,因真核生物和原
核生物细胞结构上存在差异,其前处理方法也不尽相同州。
例如,有文献报道对啤酒酵母菌采用60%甲醇溶液在一}o0c
下淬灭不会造成胞内代谢物的流失,但同样的方法应用于细
菌则会造成严重的流失万’es。因此,目前还没有一种方法具有
普遍的适用性,需要根据待测对象选择合适的前处理方法。
1. 1浮灭为了使实验测得的数据尽可能真实反映微生物
在某一特定时刻各代谢物的含量,需在提取待测物之前将微
生物内相关的代谢酶失活,即将微生物进行淬灭。常用的淬
灭方法有骤变温度法和有机溶剂法训。骤变温度法指瞬间
改变样品温度至一}00C以下或800C以上,致胞内代谢酶完全
失活。有机溶剂法指使用有机溶剂使代谢酶变性降解而失
活,最常用的淬灭溶剂是60%的甲醇溶液,但有文献报道,甘
油一氯化钠溶液比甲醇一水溶液更适合微生物的淬灭训,实验
证明该方法可有效淬灭多种微生物细胞,同时将胞内代谢物
的流失降到最少,从而达到胞内胞外代谢物的有效分离。但
该方法也存在其局限性,对丝状微生物,尤其是丝状真菌,由
于其密度较小,不能通过离心方法与甘油一氯化钠溶液分离,
此时需在淬灭后采用相对较繁琐的真空过滤方法川。
1. 2提取根据相似相溶原理,代谢物的提取效率与提取
溶剂的极性显著相关。Villas-Boa、等川在对酵母代谢组学
研究前处理方法考察时,比较了6种不同方法提取胞内代谢
物的能力,结果见表1。在衡量一种提取方法好坏时,除关
注最终代谢产物的量以外,还应确保提取过程中代谢物的稳
定,因此在提取时往往需加人缓冲液以增强代谢物的稳定
性,如乙醇胺、磷酸盐、个经乙基呱嗦乙磺酸(HEPES) ,呱嗦
乙磺酸(PIPES)等,后两者使用较为广泛川
 


1.3样品衍生化和浓缩大部分的氨基酸和小肚极性较
强,检测前常需对样品进行衍生化处理,使其适用于反相高
效液相色谱、气相色谱等方法。Kaspa:等万’n1综述了氨基酸
分析相关研究中常用的衍生化试剂以及相应的衍生化产物。
此外,由于氨基酸和小肚本身在微生物内的含量较低,且在
提取过程中又常被稀释,因此在检测或衍生化之前应通过一
定的方法进行浓缩。冻干是最常用的方法,可以去除水溶样
品中的水分,同时避免热不稳定物质的降解万’认真空离心浓
缩仪应用于非水溶液样品的浓缩较为普遍万”es。
    茹三酮( ninhydrin)作为一种常规的衍生化试剂,通常用
于阳离子交换色谱分析中的柱后衍生化。邻苯二甲醛
(OPA)既可用于阳离子交换色谱柱后衍生化,也可用于反相
色谱分析柱前衍生化。异硫氰酸苯酷(PITC)常用于反相色
谱分析柱前衍生化。氨基甲酸酷(AQC)用于柱前衍生化与
氨基酸反应生成稳定的荧光衍生产物,可用紫外、荧光、电化
学和质谱检测器检测。N一甲基一N-(三甲基硅烷)三氟乙酞胺
MS检测前的衍生化。应用毛细管电泳分离氨基酸可不进行
衍生化,但若采用光学检测器检测,亦可用异硫氰酸荧光素
(FITC)衍生化以增加灵敏度万’」es
2分离技术
2. 1高效液相色谙法
2, 1. 1反相色谱法(reverse phase liquid chromatography,
RPLC)  RPLC是常用的色谱分离方法。反相色谱的分离原
理是基于氨基酸和肚类物质与填充柱的疏水相互作用。Lu
等万’Zes运用RPI_GEl-T侧MS建立了一种对细胞内90种含氮
代谢物的定量检测方法,并采用此方法对沙门菌的胞内提取
物进行检测,准确鉴别了36种代谢物,其中包括l}种常见的
氨基酸。史春云等万川采用Sinochrom ()IWBP色谱柱,以2,个
二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生化方法对嗜碱微生物Lp3-3发酵
不同时间细胞内17种氨基酸分析,得到嗜碱微生物细胞内氨
基酸在发酵过程中的变化趋势,并简要分析了相关代谢途径。
    使用粒径为3pm的C、反相色谱柱对小肚进行分离,具
有较好的精密度、准确性及回收率。孙艳亭等万川研究了在三
氯氧磷辅助下I}经脯氨酸的成肽反应,并建立了基于RPLC-
ESl-MS/MS的对I}经脯氨酸二肚,I}经脯氨酸环二肚和I}
经脯氨酸三肚定性鉴别方法。Pctnn、等万’几es将离子对反相色
谱法(Cion pair RPLC)与电喷射质谱(EMS)联用,在30 min内
定性分析了23个小肚。
    尽管传统的反相色谱应用广泛,但由于强极性和亲水性
的小分子中极性的功能基团易于和流动相形成偶极矩作用,
即被“溶剂化”,而与非极性的固定相缺乏这种作用,导致强极
}h}组分停留在流动相中而无法与固定相作用,因此通常流出
而无法得到分离。也有研究采用离子交换色谱或离子对色谱
代替RPLC进行分离分析,如在反相色谱C、柱上应用离子对
色谱就可以分离没有衍生化的氨基酸。但这两种分离模式因
与质谱检测器的兼容性较差,导致其在氨基酸和小肚分析中
应用受限es。
2, 1. 2亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatogra-
phy, HILIC)       HILIC具有和正相色谱(NPLC)类似的保留
行为,能为强极性待测样品提供合适的保留,又具有与反相
色谱(RPLC)相似的流动相体系,与多种检测器,尤其是质
谱,有良好的兼容性。因此,HILIC-MS方法极其适用于微生
物极性代谢物分析,包括核昔酸、梭酸类、氨基酸、小肚等万’7es。
典型的HILIC流动相体系是在高比例的有机相(如乙睛)中
加人少量的水相。根据不同需要还可以使用四氢吠喃、二
烷以及醇类等有机相。Yoshida万’吕es对使用HILIC柱分离肚
类进行了详尽的综述。Yajad等万’」es进行基于LC-MS方法的
代谢组学研究,并建立了一套简单的HILIC-MS方法,在多
反应监测(MRM)模式下对复杂样品中的数百种极性物质进
行定量检测,包括各种氨基酸、核昔酸以及梭酸。
2, 1. 3多孔石墨碳(porous graphite chromatography, PUC)
填充柱PUC填充色谱柱可应用于氨基酸和肚类物质的分
离,具有保留强极性物质的能力,随着氨基酸和小肚极性的
增加,它的吸附作用增强,在反相色谱柱上不能或只能弱保
留的强极性氨基酸和小肚可以在PUC柱上有良好的保留行
为,有关文献and对PGC柱的原理、性质和应用作了研究。
PGC材料在pH值l}-l}、高温以及各种溶剂中均稳定。
Ncmcth-Kis、等=n使用PC}C柱分离出9种长度为2}-6个氨
基酸的小肚。Chaimbault等理es应用PUC柱在加人离子对试剂
的条件下实现了对20种未衍生化的蛋白质氨基酸的分离目
前PUC柱尚未广泛应用于对复杂多肚混合物的分离。
2. 2气相色谙(gas chromatography, UC)      UC广泛应用于
代谢物及代谢组学研究,其优势在于:(1)所得的数据可通过
匹配UGFI I}MS专属数据库(如NIS"h等)进行分析;(2)对
于挥发性物质,采用UC-MS可以用相对较少的花费进行高
通量的分析"'} o  Spura等飞’es应用UC-MS在18 min内定量
分析了啤酒酵母中13种常见氨基酸。Smant等川采用UC-
MS方法,对氯甲酸甲酷衍生化后的微生物胞内代谢物进行
测定,并建立了一整套的操作规程,其中包括超过100种的
氨基酸和非氨基酸类物质。由于氨基酸和小肚类物质通常
极性较大且不易挥发,因此需先对其进行衍生化。并不是所
有的衍生化产物都可以通过UC分析,如精氨酸会分解成鸟
氨酸,谷氨酸会重排成焦谷氨酸布es。此外,衍生化试剂和产
物对水都很敏感,操作过程中应严格避免水的引人。衍生化
过程繁琐是UC分析的主要缺陷,并且提取和浓缩过程中造
成的产物损失都会对测定结果的准确性产生影响。
2. 3毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)和毛细管电
色谙(capillary clcctrochromatography,CEC)     CE已经被用
于分离和检测氨基酸、肚类和蛋白质。这一方法所需的样品
量极少,也因此需要高灵敏度的检测器。激光诱导荧光检测
器是常用的检测器,衍生化的氨基酸检测限可以达到10-}n
mol。由于采用该检测技术前需要进行样品衍生化和浓缩,
整个分析时间较长,门。
    CFC综合了毛细管电泳(高分辨率、快速、高效)和
HPLC(可使用不同流动相和填充物)的优点,所使用的流动
相与质谱的兼容性更好。CFC存在的一个问题是它容易在
柱中产生气泡,这可以通过增大进口压力来解决。压力驱动
毛细管电色谱(pCEC)的流动相驱动力是电渗流和压力之
和,与单纯的毛细管电色谱相比可以快速洗脱,减少气泡的
产生。中性的反相C整体柱用于CFC,既可分离中性物质,
也可分离带电物质。其分离肚类的能力可达到理论塔板数
200 OOO ''} o  Harada等,es利用CF-MS对未经衍生化处理的
氨基酸进行了分析
3检测方法
    常见的氨基酸和肚类检测方法包括UV/Vi、法、核磁共
振波谱法(nuclear magnetic resonance, NMR)和质谱法(mass
spectrometry, MS)等。
    衍生化方法的不同直接导致UV检测波长的改变。氨
基酸检测的一个经典的方法是铿缓冲盐溶液的阳离子交换
色谱分离后,用茹三酮柱后衍生化,UV检测波长为通10一
X70 nm。异硫氰酸苯酷与氨基酸柱后衍生化生成苯胺硫甲
酞基,可在2} 1 nm波长下检测。近几年出现的A QL柱前衍
生化试剂可适用于UV和质谱检测器万’n}
    NMR能快速对样品进行高通量的分析,具有良好的重
现性,信号强度与代谢物的浓度呈线性相关,可以准确定量。
此外,NMR不需要复杂的样品前处理过程。但与质谱相比,
其灵敏度不高,而微生物内氨基酸和小肽的量又往往很低,
对NMR的使用造成了一定限制。而现有的高照射频率的商
用核磁共振仪可以达到950 MHz,提高了仪器的灵敏度和分
辨率};。将NMR应用于生物样品的代谢组学检测的文献
已有很多,les。然而由于重叠共振,lI}' HNMR不适合定量分
析川,二维NMR如2D' I]-is}.异核单量子相干谱(HSQC)的
应用则可提高测定的灵敏度,进行定量分析。Himmclrcich
等}0根据NMR检测得到的氨基酸代谢组信息,应用模式识
别的方法对来自J种酵母类型的}}2种真菌进行了分类。
    MS在结合色谱分离方法的同时,也可用直接进样法,这
一技术通常使用大气压化学电离,如ESI, APCI离子源。直
接进样是一种高通量的方法,可以在几分钟内处理一个样
品。Castrill。等les应用Ill FSI-MS对啤酒酵母胞内代谢物进
行检测,可以同时测定超过25种胞内代谢产物。利用特定
方法将色谱分离技术与质谱技术相结合,具有快速、高通量、
适用性强等优点,如Dallugc等,es建立了一种对微生物发酵
液中20种未衍生化氨基酸快速分析的方法,采用液相色谱
串联电喷雾质谱,以J种核素标记的氨基酸做内标,在1  min
内实现对全部氨基酸的定量分析。同时,若增加仪器的分辨
率则能获得更好的分析效果,如TOF-MS, FT-7CR-MS、离子
阱或使用串联质谱如Q-"h()F-MS等,通过运用高分辨质谱可
将相对分子质量几乎相同的物质进行明确鉴别,如谷氨酞胺
和赖氨酸,它们的理论相对分子质量分别为1}6. 069 12和
1}6. 105 51,可通过Q-"h()F-MS进行明确表征。尽管应用
MS可以进行高通量的分析,但是它有自身的局限性,如不能
识别对映异构体。此外,所有的样品成分同时进人FSI离子
源,可能会产生离子抑制或促进,}}
4展望
    本文结合微生物样品前处理方法,综述了目前研究中所
采用的各种分析测定氨基酸和小肚分析技术的特点及应用。
HPLC方法在分离氨基酸和小肚中起着重要作用,可根据待
测物的特点选择适当的色谱柱,但尚未有一种色谱柱可以满
足所有氨基酸和小肚的快速分离;UC具有高通量分析的特
点,灵敏度较高,但需要提取浓缩等前处理步骤,而且往往需
要衍生化,操作过程比较繁琐,也容易引人误差;CF和C FC
作为相对较新的技术,也开始被应用于微生物代谢物的分
离,具有高分辨率、快速、高效等优点,但也存在前处理繁琐、
柱中易产生气泡等问题;NMR为高通量方法,重现性好,前
处理简单,但是灵敏度相对较低,使用二维NMR可在一定程
度上提高灵敏度并更适于定量分析。
    一直以来,微生物代谢组学是研究的热点,但以现有技
术尚不足以对微生物全代谢物组进行分析。因此,研究者可
根据具体研究对象,选择某一类或几类物质进行分析。针对
氨基酸和小肚的分析,其发展应主要集中在优化前处理方
法、减少分析时间、提高分辨率以及增强检测器的适用性上。
众多分析方法中,液质联用技术,尤其是新型色谱柱结合高
分辨串联质谱技术,近年来发展迅速,体现出快速、灵敏、方
法简便、高通量、适用性强等优点,已解决了生物样品分析的
各种难题,也已应用于氨基酸、小肚的分离分析。因此,设计
并完善一套成熟的液质联用方法,同时进行全面的方法学考
察,对于微生物中氨基酸小肚分析方法的发展具有重要意
义,也是该领域PJ}待解决的问题
5利益冲突
所有作者声明本文不涉及任何利益冲突
「参考文献〕
 

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