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小肽含量检测方法—三氯乙酸氮溶指数(TCA-NSI)
发布日期:2011-12-21  来源:发酵工业网  浏览次数:11379
(一)原理    三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂,它可以沉淀蛋白质和较长的肽段。随着酶解反应的进行,蛋白质的


(一)原理
    三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂,它可以沉淀蛋白质和较长的肽段。随着酶解反应的进行,蛋白质的肽链逐渐被切成大小不等的片段,三氯乙酸氮溶指数提高。因此,三氯乙酸氮溶指数可以准确地反应蛋白质的酶解情况,溶解指数越高,表明小肽的含量越高。
(二)仪器设备
    1.实验室用样品粉碎机或研钵      2.  分析筛:孔径0.45mm(40目)
    3.  分析天平:感量0.0001g         4.  消煮炉或电炉
    5.  滴定管:酸式,10、25mL       6.  消煮管:250mL。
    7.  凯氏烧瓶:250mL              8.离心管
    9.凯氏蒸馏装置:半微量凯氏定氮装置
    10. 锥形瓶:150、250mL         11.容量瓶:100mL
    12.烧杯:250 mL                
    13.台式离心机:定时,调速,转速可达4000 转/分
    14. 普通磁力搅拌器               15. 移液管:25 mL
    16.称样皿
    17.电热式恒温烘箱:可控制温度为105±2 ℃
(三)试剂
    1.  硫酸:化学纯,含量为98%,无氮;
    2.混合催化剂:0.4g 五水硫酸铜,6g硫酸钾,均为化学纯,磨碎混匀;
    3.氢氧化钠:化学纯,40%水溶液(m/V);
    4.硼酸(GB 628):化学纯,4%水溶液(m/V);
    5.混合指示剂:甲基红0.1%乙醇溶液,溴甲酚绿0.5%乙醇溶液,两溶液等体积混合;
    6.盐酸标准溶液:邻苯二甲酸氢钾法标定,按GB 601制备;
       盐酸标准溶液:C(HCl)=0.02mol/L。1.67mL盐酸(GB622,分析纯),注入1000mL蒸馏水中
    7.硫酸铵:分析纯,干燥;
    8.三氯乙酸:分析纯,10%水溶液(m/V)。
    9.蔗糖(HG3-1001):分析纯
(四)操作方法
    取称样皿一只, 250mL烧杯一只,离心试管六只,洗净后置于烘箱中备用。
    粉碎研磨,全部过40目筛,取筛下物约5克置于称样皿中,在105℃的温度下烘干3h,取出,盖好称样皿盖,在干燥器中冷却30min,称重。再同样烘干1h, 冷却,称重,直至两次重量之差小于0.002g为恒重。
    称取恒重后的样品m1克(注:样品约2至3克),置于烧杯中,加蒸馏水75mL,室温下电磁搅拌45分钟。将烧杯中溶液及沉淀摇匀,折入离心试管中,离心后收集上清液(1号上清液)。
    注:离心转速2500转/分钟,离心时间10分钟。
    4.取1号上清夜25mL,加入25mL10%的三氯乙酸溶液,混合后静置20分钟。将烧杯中溶液及沉淀摇匀,折入离心试管中,离心后收集上清液(2号上清液)。
    注:离心转速4000转/分钟,离心时间20分钟。
    5.取2号上清液25mL,小心移入干燥的500mL凯氏烧瓶中,加入混合催化剂6.4g,再加入12mL浓硫酸和数粒玻璃珠,摇匀,将凯氏烧瓶置于电炉上加热,开始小火,待样品焦化、泡沫消失后,再加强火力,直至呈透明的蓝绿色,然后继续加热,至少2h.。待试样消煮液冷却,加入20mL蒸馏水,转人100mL容量瓶中,冷却后用水稀释至刻度,摇匀,做为试样分解液。安装好半微量蒸馏装置后, 向接收瓶内加入20mL硼酸吸收液及2滴混合指示剂,并使冷凝管下端插入吸收液内,蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴,硫酸数滴,在蒸馏过程中保持此液为橙红色,否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10mL注人蒸馏装置的反应室中,用少量蒸馏水冲洗进样入口,塞好入口玻璃塞,再加10mL氢氧化钠溶液,小心提起玻璃塞使之流入反应室,将玻璃塞塞好,且在入口处加入密封,防止漏气。蒸馏5min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面,再蒸馏1min,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均流入锥形瓶内,然后停止蒸馏。
    6.蒸馏后的吸收液立即用0.02mol/L盐酸标准溶液滴定,溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。得消耗盐酸标液V1(mL),滴定的结果用空白实验校正。
    7.另称取样品m2克(约0.5至1克),用步骤5相同的方法定氮,得消耗盐酸标液V2(mL),滴定的结果用空白实验校正。
(五)计算公式
    1.三氯乙酸氮溶指数(TCA-NSI)按式(1)计算:
    TCA-NSI(%)=((V1-V0)×m2×75)/((V2-V0)×m1×12.5)  ×100 ……(1)
式中:m1---测定可溶性氮时称取的试样质量,g;
      m2---测定总氮时称取的试样质量,g;
      V0---空白试验消耗的盐酸标准滴定溶液体积,mL;
      V1---测定可溶性氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积,mL;
      V2---测定总氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积,mL;
    2.允许误差
    每个试样取两平行样进行测定,以算术平均值为结果。两次平行测定结果绝对差值不大于3%。

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