原刊于《新饲料》杂志2007年第7期摘要 本文简要论述了微生物发酵法和酶解法生产饲用小肽产品的方法，从蛋白原料、生产工艺及操作参数、后加工处理方法等各个方面论述了小肽产品品质的影响因素，并从常规指标、小肽含量、小肽分子量分布、抗营养因子几方面，扼要论述了饲用小肽产品检测方法和质量甄别办法．告知饲料企和广大用户如何检测和甄选饲用小肽产品。关键词 小肽；检测；甄选 小肽吸收机制与氨基酸不同，小肽的吸收主要依赖H+浓度或Ca2＋离子浓度电导，是低能量消耗，逆浓度梯度转运过程，它不同于肠细胞游离氨基酸的主动运转过程，后者耗能高，易饱和，吸收速度慢。动物吸收蛋白质主要以小肽形式吸收，小分子活性多肽转运系统具有耗能低而不易饱和的特点，其吸收速度较快。研究表明，小肽的吸收对氨基酸或氨基酸残基的吸收有促进作用，当以小肽为底物时，肠腔刷状缘膜的氨肽酶活性增加，二肽酶和氨基酸载体的活性和数目也有所增加。小肽的吸收可降低游离氨基酸间的颉顽作用和竞争吸收，小肽的吸收对不同生理状态日粮变化具有较大的适应性，小肽的潜在营养作用巨大。1 饲用小肽生产方法小肽生产有5种方法：酸解法、碱解法、电解法、微生物发酵法和酶解法。酸解法、碱解法和电解法多使用于实验室研究，不适合用于饲用小肽的生产。1.1 微生物发酵法 目前，饲用小肽主要采用微生物发酵法和酶解法进行生产，从本质上讲，微生物发酵法和酶解法生产饲用小肽都是通过蛋白酶的酶解内剪切作用而产生的。微生物发酵法生产小肽是利用米曲霉、乳酸菌、芽孢杆菌等类能分泌蛋白酶的菌种，让所菌种分泌的蛋白酶在微环境下酶解蛋白质产生小肽蛋白，其肽产物的分子量分布大多在3000Da以上，分子量较大，属于多肽范畴，产品中的肽含量和可溶物含量也有一定的限制，其产品中的小肽以营养性小肽为主。微生物发酵法的优点是能较好的去除蛋白原料中的抗营养因子，生产成本低，在微生物发酵过程中加入乳酸菌、酵母菌、米曲霉、芽孢杆菌等，还可产生3％左右乳酸和发酵香味，具有酸化剂的作用，有利于提高动物采食量，改善动物胃肠道的微环境，具有肠益生的作用。含有益生芽孢杆菌的微生物发酵饲用小肽产品用于水产料，还可以改变水质，优化水产动物的生产环境，减少抗生素的应用和疾病的发生。1.2 酶解法 酶解法生产饲用小肽是以蛋白原料为底物，运用蛋白酶的酶解内剪切作用生产小肽，小肽分子量大多分布在2000Da以下，介于中小分子蛋白质和氨基酸之间，某些成分具有较强的免疫活性。酶解法生产的饲用小肽，其肽含量和可溶物含量高，小肽产品的营养性好，免疫活性强，具有较好的抗拉稀作用。但酶解水解度较难控制，任何酶制剂和酶解条件都必然产生游离氨基酸和疏水性基团，小肽产品有一定苦味，影响动物采食量，产品需要脱苦，脱苦成本较高，脱苦工艺也给小肽产品品质的控制增加了一个较难控制的工序。1.3 酶解法与微生物发酵法的联合 大多数植物蛋白原料，在单独采用酶解方法生产小肽时，产品有较强的苦味，尤其是某些含有较多疏水性氨基酸的蛋白原料，比如羽毛粉，其水解物的苦味非常强烈，对动物的采食有很大影响。在酶解后工艺加入乳酸菌、酵母菌等菌种进行发酵，能够有效去除抗营养因子，产生乳酸等风味物质，减少产品苦味，改善产品品质。但两种方法的联合使用也会导致工艺更加不稳定，生产成本也相应增高。2 饲用小肽产品品质影响因素 影响饲用小肽产品品质的因素很多，不同蛋白原料、蛋白原料不同的前处理方法，不同生产方法、工艺操作参数，不同后加工处理技术所获得的小肽产品品质往往有较大差异。2.1 不同蛋白质原料与酶的种类 不同蛋白原料被酶解获得小肽产品的品质，包括蛋白含量、肽含量、可溶物含量、营养性、免疫活性强度和免疫效果也不相同。采用酶解法生产饲用小肽产品，首先要认真选择酶解蛋白原料，不同的蛋白原料，其含有的疏水性氨基酸的含量和序列大不相同，尤其是疏水性氨基酸的种类和含量对酶解产品的适口性有很大影响，疏水性氨基酸含量高，产品适口性差，尤其是产品苦味对动物采食有很大影响。蛋白质原料的选择还要考虑氨基酸的平衡性对动物生长性能的影响。 用不同动植物蛋白质做原料，其胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的寡肽释放量有所不同，表明不同的蛋白质原料，由于氨基酸组成和序列不同，疏水性氨基酸种类和含量不同，其酶解难易程度有较大差异，比如，酪蛋白、鱼粉、蚕蛹就比豆粕、玉米蛋白、豌豆蛋白、菌体蛋白、花生蛋白、绿豆蛋白、羽毛粉等容易酶解。 不同蛋白质原料在水中的分散性有较大差异，经过粉碎或高温沸煮过的蛋白原料，起始酶解比较容易。容易酶解的蛋白原料，酶解条件温和，酶解速度快，水解度容易偏高，所产生的游离氨基酸多，可溶物含量高，肽含量不容易控制，小肽产品吸水性强，产品容易结块，生产包装储存有一定难度，在饲料生产中的使用量受到一定限制，但其产品中的小分子免疫活性肽的免疫活性较强。不容易酶解的蛋白原料，酶解条件苛刻，酶解速度较慢，水解度偏低，产生的游离氨基酸少，肽含量和可溶物含量低，小肽产品吸水性较弱，生产包装储存相对容易，其产品中的小分子免疫活性肽的免疫活性不如前者强。 在实际生产中所用的蛋白酶，比如酸性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶一般都是非专一性内切酶，其对蛋白原料的内切酶解作用是随机的。对同种蛋白原料，不同的蛋白酶对其酶解的难度也不相同，但不管选用何种酶制剂和采用什么酶解条件，都会或多或少地产生游离氨基酸。随着水解度的提高，蛋白质内部的氨基酸疏水性末端大量游离出来，小分子蛋白、小肽C一末端疏水性氨基酸残基也不断暴露，导致水解产物产生苦味。 通过调研各种蛋白原料数据库，分析蛋白质原料中各类氨基酸的种类、含量和序列，再次调研国内外营养性小肽和免疫性小肽数据库和各方面的研究成果，逐一核对各种蛋白原料中可能产生的营养性小肽和免疫性小肽，选用蛋白原料。根据可能产生的营养性小肽或免疫性小肽，分析其氨基酸序列及特性，比如疏水性、电子云结构、电势、二硫键、功能基团、酶切位阻等相关息，选定所要酶切的酶切位点，继续调研蛋白酶数据库，研究酶的特性，选择合适的酶，有目的酶解蛋白原料，这种方法对酶解产品有很大的定位效应，避免了一般酶解方法的盲目性，产品中营养性小肽和免疫性小肽的含量较高，苦味值也能控制在较低水平，产品质量能够得到较大保证。2.2 酶解工艺及操作参数 相同的酶解蛋白原料，不同的工艺和操作参数，将产生不同的酶解结果。尤其是水解度和酶解过程的重复性难以控制，蛋白酶种类，酶添加量，底物浓度，酶解温度，酶解过程控制，酶解过程加碱(酸)方式、方法、频率及加碱(酸)总量对酶解最终产品的质量都有很大影响。 蛋白酶水解蛋白是复杂的生化反应过程，既需要选择专一、高效的蛋白酶制剂，又要控制水解条件。水解度的重复性依赖于对水解条件的把握和控制程度，影响水解度的因素主要有酶解温度、酶解时间、底物浓度、加碱(酸)的频率和总量。一般来来说，酶解时间越长、底物浓度越小、加碱(酸)的频率和总量越大，蛋白的水解度越高，反之越小。蛋白原料的水解程度不够，水解产物分子量大，小肽的产率就比较低；水解过度，会产生大量游离氨基酸，就会得不到所需要的、在一定分子量范围的小肽产品。2.3 发酵工艺及操作参数 微生物发酵法生产饲用小肽，发酵菌种的筛选、保藏、培养、活化、传代对小肽产品的品质有重要影响。发酵所用的乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、米曲霉菌等菌种，一般是从相应的产品中筛选得来的，筛选出来的菌种经过诱变优化后，用沙土管保藏。菌种的传代数需要控制在一定的范围以内，当菌种不能达到发酵产品的要求时，必须重新筛选或诱变优化后才能继续使用。 发酵接种的菌种种类、接种总量、不同菌种的接种比例对发酵小肽产品的品质有较大影响，不同乳酸菌种的产酸量、生长速度、耐热性、生长习性不同，不同芽孢杆菌菌种的作用不同，有的芽孢杆菌能较旺盛的分泌蛋白酶使蛋白降解，而有的芽孢杆菌却没有这种作用。乳酸菌和酵母菌发酵能产生愉悦的酸香味，但芽孢杆菌却产生土腥味和氨味，因此这3种菌种的比例要恰当。发酵工艺过程的发酵温度，水分，传质效果，杂菌污染的控制，发酵过程的不同控制方法，比如多段控温，物料的翻动频率等因素对小肽产品质量也有较大的影响。2.4 脱苦后加工处理技术 小肽脱苦有外切酶二次酶解法、活性炭吸附法、掩盖剂掩盖法、微生物发酵法，共四种方法。2.4.1 外切酶二次酶解法 外切酶二次酶解法所使用的外切酶包括氨肽酶和羧肽酶，氨肽酶从小肽蛋白的氨基末端切掉氨基酸，羧肽酶从小肽蛋白的羧基端切掉氨基酸，但外切酶二次酶解所切下的氨基酸，其苦味阀值可能较低，甚至有可能是疏水性氨基酸，小肽蛋白中疏水性氨基酸可能再度暴露出来，增加苦味，因此这种方法的脱苦得不到有效保证，脱苦效果也不太明显。在脱苦工艺中添加风味酶，除了能产生外切酶酶解的效应，还产生美拉德反应，生成浓香昧风味物质，产品苦味有较大缓和，对动物采食有利，但脱苦成本较高。2.4.2 活性炭吸附脱苦法 活性炭吸附脱苦法是在酶解液中加入活性炭，吸附苦味肽后过滤，其脱苦效果较好，但活性炭对营养小肽和免疫活性肽的吸附不可避免，因此产品得率较低，利用价值不高，不适用于饲用小肽的生产。2.4.3 掩盖剂掩盖法 掩盖剂掩盖法是在酶解液中添加酸味剂、甜味剂或其它疏水基团包被剂掩盖苦味，掩盖剂具有诱食作用，成本较低，感官评定显示，产品甜味和酸味过后仍能品尝到较浓的苦味。2.4.4 微生物发酵法脱苦 在酶解的后段工序中，加入乳酸菌、酵母菌等厌氧发酵，可以起到综合脱苦的效果，同时产生乳香味和酒香味等风味物质，产品的诱食性较好。3 饲用小肽产品的检测3.1 常规指标 常规指标的检测包括：颜色、气味、粒度、口感、水分、粗蛋白、真蛋白、可溶物、钙、可利用磷、氨基酸含量、比重、乳酸含量、1％溶液pH值。消化能、代谢能、总能的检测比较复杂，一般要送到研究机构去测定。 除国标测定方法外，其它一些方法虽然是感官指标，但也能从一定程度上反映出产品的质量。比如，产品的颜色比较深，说明属于深度固态发酵，产蛋白酶比较多，小肽含量比较丰富，这种产品可溶物含量往往也比较高。3.2 小肽含量 饲用小肽产品中，小肽含量是表现小肽产品中是“肽”，而非“原蛋白’’或“游离氨基酸”的一个最重要的技术指标。蛋白质经蛋白酶水解，其水解中间产物为胨、肽等，最终产物为氨基酸，肽产品的总蛋白质含量包括未被水解的蛋白质和所有水解中间产物，如部分水解蛋白、胨、肽及游离氨基酸的总量。小肽的分子量小于2000道尔顿，小肽含量指标反映了产品中小肽的实际含量。 肽含量是通过检验产品中酸溶蛋白质和游离氨基酸含量，经计算差值而得。酸溶蛋白质是指能够溶解于15％TCA(三氯乙酸)溶液的可溶性蛋白，测定中除去了未水解的较大分子量的蛋白质，其结果显示出产品中(分子量在2000Dalton以下的)肽的含量。这种方法的测定结果对肽含量的范围比较敏感，一般只能对肽含量大于15％的产品测定有实际意义，对低肽含量的产品，需要继续改造才能比较。比如，把用15％TCA沉淀改成用一定浓度的乙醇溶液沉淀，测量的结果可能有新的变化。 超滤膜超滤法是目前测定小肽总含量比较简便的方法，产品溶解后，经初步离心，上清夜分 别通过截留分子量为100Dalton与10000Dalton的超滤膜，然后进行氨基酸含量测定，测定结果 就是分子量在l00Dalton至10000Dalton的小肽段组分的含量。如果要测定其它肽段组分的含量，可以改换成相应分子量孔径的超滤膜。这种测定方法比较精确，测量分子量范围也可以方便调节，但要求每次使用一个超滤膜管，有氨基酸自动分析仪，12000r／min高速离心机。3.3 小肽蛋白的分子量分布 分子量分布是肽产品的重要特性指标，直接反映着产品中不同分子量大小肽类的构成特征。肽类分子量大小最经典的方法是测定肽链长度法，即TNBS法。这种方法是通过测定水解过程中产生的游离氨基酸，推算出水解度，再通过水解度计算出平均肽链长度。这种方法只能概括地表示出样品中所有大分子及小分子蛋白水解物的平均分子量，不能直观地反映出样品中蛋白水解物的分子量分布情况。 测定蛋白质及肽类分子量的另一个方法是层析比色法。通过层析柱将不同分子量的蛋白质或氨基酸一一分开，用比色法测定其浓度，再采用已知分子量的蛋白质和肽类做标准曲线，从而计算出一定分子量范围肽类的含量。该方法与以前的方法相比有很大进步，但基本上仍属化学法，操作繁琐，人为误差较大。 测定蛋白类物质分子量最新的方法当属高效凝胶色谱法。该法是在层析比色法的基础上，进行了仪器自动化的改进，准确性高、重现性好、数据处理科学，能真实地表示出蛋白质和肽类的分子量分布。分子量分布的测定不但能定性地鉴定肽类产品的优劣、真伪，而且能定量地表示出不同分子量范围的肽的百分含量。在肽行业标准中，采用高效凝胶色谱法作为肽分子量分布的检测方法是技术上的一种突破，能分析鉴定产品的纯度，区分出什么是“蛋白质”，什么是“肽”，有利于宣传和推广“肽“这一新产品概念。 采用高效凝胶过滤色谱法和液相色谱法测定分子量分布，需要系统地研究样品的前处理方法、色谱条件、色谱柱、流动相、分子量校正曲线等因素，并经过数据处理和软件分析，可以准确地测定水解物中肽分子量分布，要求条件很高，一般只适合研究所和高校使用。 利用高分子蛋白质(分子量Mw≥2300)易为单宁在酸性条件下沉淀的原理，将肽液酸化后，加植酸钠使高分子物质沉淀，再加单宁使中分子物质沉淀，按GB／T5009.5-85分别测定滤液或滤渣中蛋白质含量，根据隆丁区分法，计算高、中低分子量小肽蛋白的百分含量，也可以从一定程度上反映出不同蛋白肽分子量区段的分布情况。只要有测定粗蛋白含量能力的企业都能用这种方法测定，但这种方法所反映的情况比较粗略。3.4 抗营养因子 豆粕中的抗营养因子主要包括大豆抗原、致甲状腺肿素、脂肪氧化酶、胰蛋白酶抑制因子、脲酶活性、植酸、大豆凝血素等。抗营养因子的指标比较多，测定非常烦琐。从大豆粕数据库中了解到，脲酶的活性和胰蛋白酶抑制剂的含量可以大致衡量发酵豆粕中的主要抗营养因子的情况。通过垂直板凝胶电泳测定分子量情况，以标准分子量蛋白做为标准区带，进行比对，可以从一定程度上看出抗营养因子的去除情况。一般来说，我们认为，脲酶的活性以定性检测24h不变红，胰蛋白酶抑制剂与大豆粕比较，相对含量10％左右，通过垂直板凝胶电泳测定分子量在20000Dalton以下，说明抗营养因子去除比较完全。4 饲料企业检测与甄选饲用小肽产品 饲料企业甄选饲用小肽产品，除了要测定颜色、气味、粒度、口感、水分、粗蛋白、真蛋白、可溶物、钙、可利用磷、氨基酸含量、比重、乳酸含量、1％溶液pH值等常规指标，还要通过测定各种小肽含量和分子量的检测方法，抗营养因子的情况等，来反映发酵豆粕的实际质量水平，同时不能单以产品价格或以粗蛋白进行产品定位。