中国农业大学动物科技学院　 孙 占田　 马秋刚 计 成　【摘要】评定饲料肽产品质量 的指标主要包 括肽含量 和肽 分子质 量的分布情况 等。本文主要介绍 了这些指标测定方 法 的研 究进 展 　。【关键词】肽 ；饲料 ；质量检测　【中图分类号】$816．17　 【文献标识 码】A　 【文章编号】1004—3314(2007)12-0025-03　 随着肽 营养 研究 的逐步 深入 ．用于 饲料工 业小肽产品开发也大量增加。小肽产品质量的高主要决定于肽的总含量以及低分子质量小肽尤是二肽和三肽的含量 ．市场上销售的饲料肽产多数是通过蛋白酶直接水解或通过微生物发酵产的蛋 白质水解物 ．水解过程中没有被降解的白质和大分子肽也包含在其 中，有些产品还加载体 。饲料小肽的质量检测指标主要包括肽含和肽分子质量的分布比例等 ．但 目前还没有简省时 、成熟可靠的饲料肽产品质量的检测方法 　．此研究人员进行 了大量的研究探索。本文旨在过现 有测 定 方法的 分析 总结 ．为饲料 小肽 产品 量标准检测方法的制定提供参考 。　肽含 量 的测定 　多数饲料小肽产品中除 了可溶性寡肽外 ．还有大量 未被水解 的完整蛋 白质和大分子质量 ．另外一些小肽产品中也含有载体 。因此判断小产品质量好坏的首要指标就是低分子质量寡肽含量。低分子质量寡肽含量越高 ，说 明肽产品的量越高。测定饲料肽中低分子质量寡肽常用蛋质沉 淀剂 沉淀饲料 肽 中完整蛋 白质 和大分子沉淀蛋 白质的常用方法有盐析法 (氯化钠 、硫钠 、硫酸铵等)、酸沉法(鞣酸及三氯醋酸)、有机剂沉淀法(甲醇 、乙醇 、丙酮等)和重金属盐沉淀(醋酸铅 )等。经试验表 明．硫酸铵中的 NH4+中有 N．所以往往对最终用凯氏定氮法测定总粗蛋白 质的 含量 有一定 的 影 响： 鞣酸 有颜 色干 扰 ．如用分光光度法就会使结果出现极大的偏差 ．因此三氯醋酸沉淀法最常用。　上清液的肽含量一般采用凯氏定氮法、双缩脲法、紫外光吸收法、隆丁分 区法和氨基酸法等进行测 定。 因 为在蛋 白质水 解过 程 中 产 生少量 游离氨基酸．因此应该测定上清液中游离氨基酸的含　量 ．饲料肽中低分子肽含量等于上清液中总氨基酸含量减去游离氨基酸含量(王丽娟，2003)。张翠凤等 (2004)报道 ，用 75％乙醇作 为蛋 白质沉 淀剂 ．而后用双缩脲法测定肽含量和用隆丁分区法测定 的 结 果相 一致 。　2 肽产 品肽分 子 质量分 布 的测定 　饲料肽产品中低分子质量肽含量仅是反映产品质量的总体情况 ．肽分子质量的分布情况才是反映产品的真正质量 。肽产 品中分 子质量 低于1000　u的寡肽含量越 高 ．说明产 品质量越好 。国内外对肽 的分子质量分布测定 已开发 出不 少方法 ．其中常用 的有超滤法、色谱法和电泳法等。　2．1 超滤法 超滤法 由于可 以按膜 的截 留分子质量对所要分离的物质进行分离 ，所 以用于肽混合物 的分离具有工艺流程短 、耗用化学试剂少等优点 ．是较有前途的方法 (Pouilot等 ，1999)。超滤原理 近似机械筛分 ．是利用膜 的选 择性 ，在膜的两侧存 在一定量的能量差作为推动力 ，通过溶液中各组分透过膜 的迁移 速率 的不 同而实现非均相物系 的分离 。常用超滤膜根据截留分子质量的　不 同可分为 以下几种 ：1、3、5、8、10　ku等 。蛋 白质水解液经过超滤分为几种组分液 ，而后再分别测定各组分液的肽含量或肽分 子质量 的分布情况 。　陈山和杨晓泉(2003)研究结果表明超滤技术不仅能直接从发酵产物中分离出纯度较高的大豆肽．而且可以作为一种检测手段用来分析发酵产物 中组分的相对分子质量分布。王丽娟(2003)用中空超滤器对蛋 白质水解物进行 了超滤分离 ．取得 了很好的效果。江连洲等(2oo4)对超滤膜的清洗条件进行了研究 ，结果显示．大豆肽超滤分离过程膜清洗的最佳工艺为 ：先用 30～40℃温水清洗膜 05．　h，用 0．5％含酶清洗剂在 40℃下清洗05．　h，再用 40～50℃温水清洗膜 1　h．膜通量的恢复 度 达到 74．63％。　22．　 色谱法　 高效液相色谱(HPLC)尤其是反相高效液相色谱法 (RP—HPLC)可有效用于蛋 白质水解物中肽的分离和肽分子质量分布的测定。当HPLC技术用于测定蛋 白质水解物的肽分子质量分布 时 ，可使用 TSK柱 。Nakamura等 (1993)在HPLC上使用两个 TSK凝胶 G3000　PWx1柱估测了蛋 白质水解物的肽分子质量分布。在测定乳清蛋 白水解物的分子质量范围时两个柱子可以连在一起使用。　冯 秀燕 (2001)研究 了 3种 C18反相 柱 如 SPHERISORB　ODS柱 (3　I．zm，5　mmx250　mm)、NUCLEOSIL　C18柱 (5　 m，250　mmx46．　mm)和LICHROSORB　RP一18(7　m)分离小肽 的效果 ，研究结果表明 ，SPHERISORB　ODS柱(3　．Izm，5　mm￣250　mm)￣Jl定结果的精密度 、准确性、回收率及保留时间的稳定性最好 。最佳色谱条件为：固定相 　：SPHERISORB　C18　ODS反 相 色 谱 柱 (3　．Izm．5mmx250　mm)：流动相 A：0．1％ TFA 的水溶 液 ．流　动相 B：0．1％TCA的 ACN溶液 ：流速 ：lmLm／in　：进样量 ：20　L；紫外检测波长 ：225　nm。　杨文鸽等 (2005)利用凝胶排阻高效液相色谱　法测定了蚌 肉酶解蛋 白质粉中肽相对分子质量的分布。层析条件为 ：Tsk　C　2000柱 ．流动相为 45％乙腈和 0．1％ TFA，柱温 30℃， 流速 05．　mL／min　，检测器波长 220　nm。汤国营等 (2006)利用凝胶过　滤高效液相色谱法测定 了大豆低聚肽的分子质量为水 ，流速 0．5　mL／min，上样量 10～20　L。刘妍妍和张丽萍 (2006)采用高效凝胶排阻色谱对离子交换层析分离出的组分进行分子质量分布 的测定。所用的色谱条件 ：色谱柱为 TSK—GELG2000SWxL　7．8　mmx300　mm，粒度 5　 m；流 动相 为含 05．　g／L(质量浓度 )三氟乙酸的 100　g／L(质量浓度 )乙腈水溶液 ；检测波长为 214　nm；柱温为室温 ；流速 为 1．0　mL／min；进样 量 为 1　L 。　曾晓波 (2002)用葡聚糖凝胶 Sephadex　G一25层析分析了菜籽蛋 白水解物中肽分子质量分布 　．层 析 条件 ：Sephadex　G一25的粒 径 为 150～200目，层析柱 2．6　emx40　cm，蒸馏水作流动相 ，流速 　：0．6　mL／min．紫外吸收法(280　nm)检测 ，收集 出峰时的 流 出液。 　大小排阻色谱 (SEC)尤其是大小排阻高效液相色谱 (SE—HPLC)和凝胶 渗透色谱 也是研究 蛋白质水解 物肽谱 的有效工 具 。常用 的凝 胶有 　：Sephadex　G一25、Sephadex　G-15和 Sephadex　G一50。Visser等(1992)在研究乳蛋 白水解物的分子质量分布时 ．检测 了琼脂糖凝胶 (Superose一12　HR10／30)和琼脂糖改 良凝胶 (Superdex一75　HR　10／30)的效果 。Lemieux和 Amiot(1990)利用 5种色谱方法 (大小排阻、反相 、离子交换 HPLC，凝胶过滤 ，固化金属离子亲和 )对市场上销售的酪蛋 白水解物进行 了分离。结果显示．HPLC比其他色谱法(SEC和金属亲和色谱 )表现 出许多优点 ．如耗 时短等。目前的研究结果显示，分析肽分子质量分布的最好 的方法 是 SE—HPLC。　23．　 电泳技 术　2．3．1　 三 (羟甲基 )甲基甘氨酸 (Trieine)一聚丙烯酰胺凝胶 电泳 (PAGE)。常用 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS—PAGE)可从不同方面鉴定 一 些 蛋 白质 水 解 物 。 Desphande和 Nielsen(1987)使用 SDS—PAGE比较 了不同水解条件下产生 的云扁豆蛋 白水解 物的肽分子质量分 布情况。通过 SDS—PAGE也可管理乳清蛋白的不同酶解阶段产生的肽分子质量的分布状况 Perea等 　．1993)。　用三 (羟 甲基 )甲基甘氨酸代替传统的甘氨酸 ，并在常规 SDS—PAGE分离胶与浓缩胶 的基础上增加了一层凝胶 ，即灌注分离胶 、间隙胶和浓缩　分布。所用色谱条件为：Waetrs　Pak60柱 ．流动相　胶三层凝胶 ．减小电流延长电泳时间 ．供试品胶用　Serva蓝 G试剂染色 。明显提高了小分子肽 的分辨率 ：凝胶为 l65． ％交联度 、6 ％浓度时分离效果最佳 ．能达到相对分子质量为 5000—20000的肽的分离 ；甚至能观察到相对分子质量小至 1000的肽不 太清 晰 的色带 (Schagger和 Jagow，1987)。　王旭等 (2003)也证 实这种三 (羟 甲基 )甲基甘氨酸 一SDS—PAGE 系 统 对 相 对 分 子 质 量 l00020000的多肽有较好 的分辨率 　。曹佐武(20o4)以 Tricine—SDS—PAGE三层凝胶系统为基础 ，研究出另一种有效分离相对分子质量 l000小肽的方法 。除了在分离胶中加入尿素外 ，还采用 5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶 。改进后低分子质量和特低分子质量肽 ．尤其是相对分子质量 l000的小分子的带型也能清晰显示。　Baumann等(1996)采用微制备凝胶电泳 ，成功地分离纯化 了 3种难溶的小分子淀粉样肽 (从呈细丝淀粉样物质中提纯得到 )。这种将连续洗提微制备凝胶电泳装置与 Tricine—SDS—PAGE相结合 的方法 ．还 能将两个相对分子质量 分别 为4329和 3289(相差仅 1045)的小 肽清楚 地分离开 。　Sarfo等(2003)开发 了一种经济 、灵敏且重复性好 的小分子肽分离方法。此法使用 比上述几种Tricine—SDS—PAGE 便 宜 得 多 的传 统 甘 氨 酸 一SDS—PAGE系统。与常规 PAGE比较 ，凝胶系统中的 SDS(0．1％)浓度更 低 。他们还 用甘 氨 酸一SDS—PAGE和醋酸一尿素两种凝胶分别分离 l0种小肽并进行了比较 ．后者仅适用于低 pH值下碱性肽类 的分离 ．前者则能快速分离具有不 同等电点 、分子大小和疏水性 的相对分子质量 1000—3000小分子肽。　2．32． 毛细管电泳(CE)。毛细管电泳具有高灵敏度和高分辨率的特点 ．也可用于蛋 白质水解物肽分布的研究 。Castagnola等(1991)指出 ，CE结 合RP—HPLC测定蛋白质水解物中肽分子质量分布 　．可得出比较准确的结果。这是因为 ，RP—HPLC的分离依据极性 ，而 CE则根据肽的电荷。　3　 小结 　饲料肽产品的肽含量测定主要采用蛋 白质沉淀法 ，其中沉淀剂种类很多各有优缺。分子质量分布的估测通常使用超滤法、色谱法和电泳法 ．其中SE—HPLC法的测定结果最好 。但测定饲料肽制剂质量的简单快速准确的方法还不多 ．有待进一步开发 研究 。　参考文献　1【】曹佐武．有效 分 离1 　kDa小肽的 Trcinie—SDS—PAGE方法U]．中国生物　工程杂志，2004，24(1)7：4—76　．2【】陈山 ，杨晓泉 ．大豆肽溶 液超滤传质过程 的研 究 U]．化工装备技术 　，20032，4(1)3：～6　．3【】冯 秀燕鸡 饲料蛋白 质寡肽水解量与氨基酸 利用率的关 东【：硕 士学位论　文p】】．北京，中国农业大学，200　14【】江连洲， 黄莉，朱秀 清， 等 大豆肽 超滤分离 过程膜清 洗的研究 U]．中国油　脂 2．004．8：45—4 6　．5【】刘妍妍， 张丽萍牛．乳酪蛋 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